發(fā)布時(shí)間：2018-04-15 00:24

  本文選題：獼猴川西亞種 + 腫瘤壞死因子α��； 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是一種強(qiáng)效的細(xì)胞因子,在參與免疫反應(yīng)、炎癥、損傷反應(yīng)、控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡均能發(fā)揮作用。TNF-α及其抑制劑對(duì)于多種疾病的早期診斷、預(yù)后判斷和治療方面都有重要作用。獼猴川西亞種已用于多種人類重大疾病非人靈長類模型的構(gòu)建,是研究TNF-α生物制劑對(duì)多種疾病影響的高價(jià)值實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。到目前為止,TNF-α在人和其他動(dòng)物方面研究較多,但對(duì)獼猴TNF-α的研究較少,國內(nèi)還未見獼猴川西亞種(Macaca mulatta lasiotis，Mm) TNF-α克隆表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究通過基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α,并構(gòu)建MmTNF-α基因的原核和真核表達(dá)菌株,并進(jìn)行表達(dá),為深入研究MmTNF-α蛋白活性功能、結(jié)構(gòu)功能、制備單克隆抗體、開發(fā)檢測(cè)試劑盒奠定物質(zhì)基礎(chǔ),也為保護(hù)獼猴川西亞種提供資料。1、獼猴川西亞種TNF-α基因的克隆與原核表達(dá)參照NCBI/GenBank上登錄的獼猴TNF-α mRNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,利用基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α全長轉(zhuǎn)錄本為模板,PCR擴(kuò)增目的基因,將其定向插入pMD-19T上,構(gòu)建重組菌DH5a/pMD-19T-MmTNF-α,隨機(jī)挑取陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定及序列測(cè)定分析。擴(kuò)增獲得的MmTNF-α基因?yàn)?02bp,測(cè)序結(jié)果和GenBank上發(fā)布的獼猴TNF-α序列(NCBI Reference Sequence:NM_001047149.1)比對(duì),同源性為99%。根據(jù)測(cè)序成功的MmTNF-α基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)表達(dá)引物,經(jīng)亞克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-MmTNF-α,進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定,并在E.coliBL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)。在37℃下,0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)原核表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)/pGEX-4T-1-MmTNF-α4 h,獲得大小約為52 kDa且主要以包涵體形式存在的融合蛋白,與預(yù)期大小一致經(jīng)過WB分析證實(shí)重組蛋白具有良好免疫反應(yīng)性。2、獼猴川西亞種TNF-α真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)將實(shí)驗(yàn)室克隆的MmTNF-α基因插入pPIC9K多克隆位點(diǎn), Sal I線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-MmTNF-α,經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化GS115。PCR鑒定陽性克隆,用PCR、MM和MD平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子表型鑒定,G418梯度平板篩選高拷貝重組菌。重組菌pPIC9K-MmTNF-α/GS115利用甲醇誘導(dǎo),SDS-PAGE和Western-blot分析表達(dá)結(jié)果。真核表達(dá)菌株GS115/pPIC9k-MmTNF-α表型鑒定為甲醇誘導(dǎo)緩慢型Muts,在30℃下,1%甲醇連續(xù)誘導(dǎo)72 h后在上清中檢測(cè)到大小約為26 kDa的目的蛋白,WB分析表達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)性。
[Abstract]:Tumor necrosis factor alpha (tumor alpha necrosis factor-alpha, TNF-) is a potent cytokine, involved in immune response, inflammation, injury, control of cell proliferation, cell differentiation and cell apoptosis could play a role in.TNF- alpha and its inhibitor for the early diagnosis of various diseases, prognosis judgement and treatment have an important role. Macaca mulatta lasiotis has been used to construct a variety of major human diseases nonhuman primate model, is of high value in experimental animal study on effect of TNF- alpha biological agents for a variety of diseases. So far, TNF- alpha in human and other animal study more, but the research on rhesus monkey TNF- alpha less, there is no domestic monkeys in Western Sichuan species (Macaca mulatta lasiotis, Mm) reported a cloning and expression of TNF-. This study was MmTNF- by gene cloning, MmTNF- gene and construct the prokaryotic and eukaryotic expression strain, And for the further study of MmTNF- expression, protein activity, structure and function, preparation of monoclonal antibody, lay the material foundation development kit,.1 also provides information for the protection of Macaca mulatta lasiotis, Macaca mulatta lasiotis cloning TNF- gene and prokaryotic expression of monkey TNF- alpha mRNA sequence NCBI/ reference GenBank login a pair of primers were designed to obtain full-length transcripts, alpha MmTNF- as template by gene cloning technique, PCR gene, inserted into pMD-19T, construction of recombinant DH5a/pMD-19T-MmTNF- alpha, randomly selected positive recombinant was analyzed by PCR identification and sequence amplification. The MmTNF- gene was 702bp, rhesus TNF- alpha sequence released sequencing the results on the GenBank (NCBI Reference Sequence:NM_001047149.1) on 99%. homology according to the sequencing of successful MmTNF- alpha gene sequence pairs of primers were designed and synthesized, by PCR was subcloned to construct the prokaryotic expression vector of pGEX-4T-1-MmTNF- alpha, and by double digestion, and E.coliBL21 (DE3) for expression. At 37 DEG C, 0.1mmol/L IPTG induced expression of prokaryotic expression strain E.coli BL21 (DE3) /pGEX-4T-1-MmTNF- alpha 4 h, was about the size of the fusion protein of 52 kDa and mainly in the form of inclusion in the body, consistent with the expected size after WB analysis confirmed that the recombinant protein had a good immune response of.2, Macaca mulatta lasiotis construction and expression of MmTNF- alpha gene cloned into pPIC9K multiple cloning sites of eukaryotic expression vector of TNF- alpha, Sal I linearized recombinant plasmid pPIC9K-MmTNF- alpha, GS115.PCR was identified by electroporation cloning, PCR, MM and MD tablet of transformant phenotype, G418 gradient plate screening high copy recombinant bacteria. Recombinant pPIC9K-MmTNF- alpha /GS115 induced by methanol, SDS-PAGE and Western-blot expression analysis Results the eukaryotic expression strain GS115/pPIC9k-MmTNF- alpha phenotype was identified as methanol induced slow Muts. At 30 C, 1% methanol was continuously induced for 72 h, and the target protein of 26 kDa was detected in the supernatant. The expression product of WB analysis showed immunoreactivity.

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 謝寶樹，劉麗;不同啟動(dòng)子對(duì)腫瘤壞死因子α在大腸桿菌中表達(dá)水平的影響[J];空軍總醫(yī)院學(xué)報(bào);1996年01期

2 徐春曉;人腫瘤壞死因子α的結(jié)構(gòu)和衍生物研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1999年03期

3 黃榮清，杜澤涵，，楊志剛，馮銳;腫瘤壞死因子α對(duì)白血病細(xì)胞作用的~（31）P核磁共振研究[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1996年02期

4 柴彪新,湯仲明,屠敏;腫瘤壞死因子α突變體免疫活性的檢測(cè)[J];上海免疫學(xué)雜志;1997年06期

5 楊麗萍;姚詠明;葉棋濃;盛志勇;;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α表達(dá)的結(jié)合位點(diǎn)研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年12期

6 王桂香,王楠,劉琳,吳白燕;白介素-6及腫瘤壞死因子α對(duì)新生兒低出生體重的影響[J];生物學(xué)通報(bào);2004年07期

7 劉麗,趙建增,李景泰,謝寶樹,冷愛軍,杜孝元;重組人腫瘤壞死因子α衍生物11a與原型腫瘤壞死因子α對(duì)小鼠的急性毒性比較[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;1997年03期

8 林麗珠,趙壽元,李昌本;腫瘤壞死因子α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用[J];生命科學(xué);1999年04期

9 張建民,李平風(fēng),顧文霞,袁越,杜國光;腫瘤壞死因子α對(duì)ROS17/2.8細(xì)胞甲狀旁腺素受體的下行調(diào)節(jié)[J];生物化學(xué)雜志;1992年06期

10 丁衛(wèi),馬碩,杜國光;腫瘤壞死因子α對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞增殖與甲狀旁腺素受體表達(dá)的影響[J];生物化學(xué)雜志;1997年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張慧;胡義揚(yáng);;腫瘤壞死因子α、脂聯(lián)素與非酒精性脂肪性肝病[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

2 張?jiān)葡?馮春梅;李偉;王家富;;蜂膠對(duì)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[A];第八次全國動(dòng)脈硬化性疾病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

3 鄒水蘭;王廣發(fā);張成;林琴;顧江;張瑛琪;;嚴(yán)重急性呼吸綜合征肺組織中腫瘤壞死因子α的表達(dá)及意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

4 蒲杰;曾蔚越;;腫瘤壞死因子α基因啟動(dòng)子-308位點(diǎn)多態(tài)性與中國西部漢族早產(chǎn)的相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

5 馬麗;柴家科;申傳安;;腫瘤壞死因子α致骨骼肌細(xì)胞凋亡的體外研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

6 李志忠;譚薇;王樂強(qiáng);郭桂芳;王洪剛;黃寶娥;;瘦素、腫瘤壞死因子α與慢性阻塞性肺疾病患者營養(yǎng)狀況及免疫功能的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

7 薛玉文;姜虹;李鳳云;杜以明;;阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者腫瘤壞死因子α基因多態(tài)性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

8 李潔;李秀鈞;陳國弟;辛軍平;;B049.腫瘤壞死因子α啟動(dòng)子基因多態(tài)性與循環(huán)瘦素、神經(jīng)肽Y、腫瘤壞死因子水平[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

9 趙玉玲;馮衛(wèi)東;鮑立春;;肺內(nèi)細(xì)菌感染患者血清及肺泡灌洗液白介素-8、白介素-6、腫瘤壞死因子α檢測(cè)及意義[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

10 宋衛(wèi)青;;腫瘤壞死因子α致體外肝細(xì)胞凋亡效應(yīng)的研究[A];第五次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 劉 萍　崔銀珠;癌癥厭食及惡病質(zhì)的機(jī)制與治療[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 劉曉穎;腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的cIAP_2蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

2 崔廣林;高脂血癥的遺傳變異及炎癥與心腦血管病關(guān)系的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙瓊;腫瘤壞死因子α對(duì)成肌細(xì)胞系C2C12的作用及機(jī)制的研究[D];蘇州大學(xué);2016年

2 朱沿秋;獼猴川西亞種腫瘤壞死因子α基因的克隆及表達(dá)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 王琪;外周血腫瘤壞死因子α與神經(jīng)根型頸椎病疼痛程度的相關(guān)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2008年

4 王威;姜黃煎劑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷大鼠熱休克蛋白27和腫瘤壞死因子α表達(dá)的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 辛雅萍;脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α與2型糖尿病合并冠心病關(guān)系的研究[D];鄭州大學(xué);2006年

6 陸逢春;腫瘤壞死因子α誘發(fā)重癥急性胰腺炎低鈣血癥的分子機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

7 宋春來;腫瘤壞死因子α、脂聯(lián)素對(duì)冠心病的影響分析[D];青海大學(xué);2013年

8 朱立榮;腫瘤壞死因子α與游離脂肪酸在肥胖和2型糖尿病患者中的異常表達(dá)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2002年

9 宋愛萍;腫瘤壞死因子α對(duì)體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[D];青島大學(xué);2005年

10 陳震球;基因工程菌pTrcHis2A-hTNF-α-JM109生產(chǎn)人腫瘤壞死因子α的研究[D];暨南大學(xué);2002年

本文編號(hào)：1751703