本文關(guān)鍵詞：TSA促進轉(zhuǎn)基因豬體細胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

HEREDITAS (Beijing) 2011年7月, 33(7): 749―756 ISSN 0253-9772

研究報告

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00749

TSA促進轉(zhuǎn)基因豬體細胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達

孔慶然, 朱江, 黃波, 郇延軍, 王峰, 石永乾, 劉仲鳳, 武美玲, 劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030

摘要: 不完全的表觀遺傳重編程是造成轉(zhuǎn)基因克隆動物效率低下的主要原因, 組蛋白修飾作為表觀遺傳修飾

的一個重要部分, 可以直接影響克隆胚胎的發(fā)育和外源基因的表達情況。TSA(Trichostatin A)作為一種組蛋白去乙�；种苿�, 可以改變組蛋白的乙酰化水平, 促進表觀遺傳重編程, 提高克隆動物的效率。同時TSA能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu), 使轉(zhuǎn)錄因子易于與DNA序列結(jié)合, 促進外源基因的表達。文章確定了TSA處理轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞和核移植胚胎的最佳條件, 分別為250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h, 通過進一步正交實驗發(fā)現(xiàn), TSA同時處理供體細胞和克隆胚胎可以顯著的促進核移植胚胎的體外發(fā)育。此外, 無論TSA處理轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞或核移植胚胎, 都可以提高外源基因的表達水平。

關(guān)鍵詞: TSA; 體細胞核移植; 胚胎發(fā)育; 外源基因表達; 豬

TSA improve transgenic porcine cloned embryo development and transgene expression

KONG Qing-Ran, ZHU Jiang, HUANG Bo, HUAN Yan-Jun, WANG Feng, SHI Yong-Qian, LIU Zhong-Feng, WU Mei-Ling, LIU Zhong-Hua

College of Life Science, Northeast Agricultural University of China, Harbin 150030, China

Abstract: Uncompleted epigenetic reprogramming is attributed to the low efficiency of producing transgenic cloned animals. Histone modification associated with epigenetics can directly influence the embryo development and transgene expression. Trichostatin A (TSA), as an inhibitor of histone deacetylase, can change the status of histone acetylation, im-prove somatic cell reprogramming, and enhance cloning efficiency. TSA prevents the chromatin structure from being con-densed, so that transcription factor could binds to DNA sequence easily and enhance transgene expression. Our study estab-lished the optimal TSA treatment on porcine donor cells and cloned embryos, 250 nmol/L, 24 h and 40 nmol/L, 24 h, re-spectively. Furthermore, we found that both the cloned embryo and the donor cell treated by TSA resulted in the highest development efficiency. Meanwhile, TSA can improve transgene expression in donor cell and cloned embryo. In summary, TSA can significantly improve porcine reconstructed embryo development and transgene expression.

Keywords: TSA; somatic cell nuclear transfer; embryo development; transgene expression; pig

收稿日期: 2010?10?15; 修回日期: 2010?12?21

基金項目:轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(編號：2008ZX08006-002, 2009ZX08006-001B)和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“創(chuàng)新團隊”發(fā)展計劃項目資助

作者簡介:孔慶然, 博士, 講師, 研究方向：胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動物。Tel: 0451-55191747; E-mail: kqr1982@yahoo.com.cn

朱江, 碩士, 研究方向：胚胎工程。Tel: 0451-55191747; E-mail: zhujiang1021@yahoo.cn

孔慶然和朱江同為第一作者。

通訊作者:劉忠華, 博士, 教授, 研究方向：胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動物。E-mail: liu086@yahoo.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2011-5-23 16:48:25

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750 HEREDITAS (Beijing) 2011 第33卷

轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過近半個世紀的發(fā)展, 已成為當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點。近10多年來, 與核移植技術(shù)的結(jié)合, 轉(zhuǎn)基因效率大大提高, 攜帶有不同外源基因的不同種類的轉(zhuǎn)基因動物迅速增加[1]。近年來, 體細胞克隆豬、轉(zhuǎn)基因細胞克隆豬相繼誕生[2~5], 這些突破極大的促進了基礎(chǔ)研究的發(fā)展, 推動了生物醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)生產(chǎn)的進步[6]。

雖然我們已經(jīng)能夠得到體細胞克隆豬, 但是克隆豬的效率依然較低。造成克隆豬效率低下的一個重要原因是不徹底的表觀遺傳重編程[7]。研究表明, 體細胞不徹底的表觀遺傳重編程, 會嚴重影響核移植胚胎的發(fā)育[8], 卵母細胞胞質(zhì)對體細胞核徹底的重編程, 是決定核移植胚胎發(fā)育, 產(chǎn)生克隆動物的一個重要條件[9]。組蛋白乙酰化作為表觀遺傳修飾的一個重要部分, 在核移植胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用[10]。組蛋白乙酰化可以使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散, 促進轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合, 進而促進相關(guān)發(fā)育基因的正常表達。研究表明, H3K9的乙酰化與染色質(zhì)的活性構(gòu)象相關(guān)[11], H4K16的乙�；瘎t直接影響染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的包裝[12]。

曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是一種去乙�；敢种苿�, 其通過抑制去乙酰化酶的活性來提高組蛋白的乙�；潭�。TSA處理供體細胞和克隆胚胎, 可以促進胚胎發(fā)育相關(guān)基因Oct4、Sox2、FGF4、c-Myc、Klf4、Enomes和 Cdx2的表達[13], 從而顯著促進小鼠、牛等動物克隆胚胎的發(fā)育[14,15]。在豬上, 已有實驗表明用TSA處理核移植胚胎可以顯著提高其體外發(fā)育率

[16]

與克隆豬的

出生率[17]。但是用TSA處理后, 出生克隆豬的死 亡率較高[16], 這使得我們擔(dān)心TSA對胚胎是否有負面作用。因此我們需要進一步探索TSA處理供體細胞和核移植胚胎的最適濃度和時間, 得到最佳的處理方式。轉(zhuǎn)基因動物中, 普遍存在著外源基因沉默的現(xiàn)象, 外源基因的沉默與表觀遺傳修飾密切相 關(guān)[18], TSA作為組蛋白乙酰化修飾的調(diào)節(jié)藥物, 能否促進轉(zhuǎn)基因細胞或轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚中外源基因的表 達, 至今尚無相關(guān)研究報道。探索TSA對轉(zhuǎn)基因細胞及其核移植胚胎中外源基因表達的影響, 可使我們進一步了解外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的表達情況及其 調(diào)節(jié)機制, 為轉(zhuǎn)基因動物的培育奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

胎兒成纖維細胞取自妊娠32 d長白豬胎兒, eGFP轉(zhuǎn)基因細胞取自體細胞核移植技術(shù)產(chǎn)生的eGFP轉(zhuǎn)基因克隆豬; 豬卵巢取自哈爾濱呼蘭屠宰場。 1.2 方法

1.2.1 成纖維細胞的分離和培養(yǎng)

在豬場采集妊娠母豬的子宮或成豬耳部組織,

置于37℃添加雙抗的生理鹽水中, 迅速運回實驗室。從豬子宮中取出胎兒, 用PBS清洗干凈, 去除四肢、頭部, 眼科剪充分剪碎; 耳部組織用PBS清洗干凈后直接剪碎。加入3 mL 1 mg/mL膠原酶, 置于37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化2~3 h。消化后2 000 r/min離心10 min, 去上清液, 用4 mL培養(yǎng)液(高糖DMEM+ 10% FBS)重懸, 1 000 r/min離心5 min, 去上清, 再用細胞培養(yǎng)液重懸細胞/細胞團塊液, 取2~3 mL移入φ=7 cm培養(yǎng)皿中并加入4 mL培養(yǎng)液, 置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁50%~60%時, 半量更換培養(yǎng)液, 以后每2 d全量換液一次, 并觀察細胞生長情況; 待細胞長滿培養(yǎng)皿底80%~90%時, 吸去培養(yǎng)液, 用DPBS清洗2~3次, 加入0.5 mL 0.25%胰酶消化2~4 min, 用等量細胞培養(yǎng)液終止消化, 輕輕吹打成單細胞懸液, 1 000 r/min離心5 min, 細胞培養(yǎng)液將所得細胞沉淀制成懸液, 以1~2×106個/mL細胞濃度接種在9 cm培養(yǎng)皿中, 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每2 d全量換液一次。3~5代后可用于后續(xù)實驗。

1.2.2 核移植胚胎的構(gòu)建

1.2.2.1 卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng) 將屠宰場收集的卵巢置于37℃添加雙抗的生理鹽水中, 運送回實驗室。用注射器抽取卵巢表面直徑為3~6 cm的卵泡, 收集含有卵丘卵母細胞復(fù)合體的液體, 用TL-HEPES洗2次后, 在顯微鏡下挑選具有3層以上卵丘細胞的卵丘卵母細胞復(fù)合體進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液為改進的TCM199加10% 卵泡液, 培養(yǎng)條件為39℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱。成熟培養(yǎng)42 h后, 用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化卵丘卵母細胞復(fù)合體, 去除卵丘細胞, 在顯微鏡下挑選帶有極體的卵母細胞,

第7期

孔慶然等: TSA促進轉(zhuǎn)基因豬體細胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達 751

作為成熟卵母細胞, 用于核移植實驗。

1.2.2.2 體細胞核移植 將成熟的卵母細胞置于7.5 mg/mL細胞松弛素B的操作液中, 采用盲吸法, 在顯微鏡下吸出第一極體及其周圍的部分胞質(zhì), 以吸出1/4左右的胞質(zhì)認為完全去核。選取外表光滑、發(fā)亮的細胞, 注入透明帶和質(zhì)膜之間, 使供核細胞與質(zhì)膜緊密接觸。

1.2.2.3 融合與激活 采用電擊的方法, 一步實現(xiàn)融合與激活。將胚胎置于融合液中, 使兩細胞的接觸面與兩電極的連線垂直, 1.2 kv/cm、30 μs直流電電擊2次。在豬胚胎培養(yǎng)液靜置30 min后, 選取融合的胚胎, 進行胚胎培養(yǎng)。

1.2.2.4 核移植胚胎的體外培養(yǎng) 融合的胚胎置于PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為39℃、5% CO2、飽和濕度。培養(yǎng)至36 h檢測卵裂率, 156 h檢測囊胚率及囊胚細胞數(shù)。

1.2.3 成纖維細胞與核移植胚胎的藥物處理

在細胞培養(yǎng)液中添加相應(yīng)質(zhì)量的TSA, 使其到達指定的濃度, 用此培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞, 達到處理時間后, 更換正常的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

在PZM-3中添加相應(yīng)質(zhì)量的TSA, 使其到達指定的濃度, 將重構(gòu)胚置此培養(yǎng)液中, 達到處理時間后, 清洗, 再移入正常的PZM-3中培養(yǎng)。 1.2.4 細胞形態(tài)觀察與活率分析

收集各不同處理條件下的成纖維細胞, 在光鏡下觀察細胞形態(tài), 采用Computer-assisted cell analysis system (CASY) I cell-analyzing unit (Sch?rfe Systems, Reutlingen, Germany)細胞分析儀檢測細胞活率。 1.2.5 流式細胞儀分析

將GFP轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞用胰酶消化, PBS清洗后懸浮, 進行流式細胞儀檢測。細胞檢測時, 激發(fā)波長設(shè)為488 nm, 接受波長設(shè)為525 nm, 并通過對野生型豬成纖維細胞(對照)的檢測, 確定測量點(排除陰性細胞的自發(fā)熒光)、檢測門(排除細胞碎片和死細胞)和檢測速度(保證細胞的生物活性)。 1.2.6 實時定量PCR分析

提取核移植胚胎的總RNA(RNeasy Mini Kit,

Qiagen), 將提取的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA (PrimeScriptTM RT Reagent Kit, TaKaRa), 然后用Real-time PCR檢測GFP基因的表達情況(SYBR Premix Ex TaqTM , TaKaRa)。GFP的上游引物為5'-TGAACCGCATCGA GCTGAAGGG-3', 下游引物為5'-ACCTTGATGCC GTTCTTCTGCTTG-3', 18S rRNA作為內(nèi)參, 其上游引物為5'-TCCAATGGATCCTCGCGGAA-3', 下游引物為5'-GGCTACCACATCCAAGGAAG-3'。 1.2.7 熒光分析

收集不同時期的GFP轉(zhuǎn)基因細胞核移植胚胎, 使用蛋白酶K去掉透明帶, 固定、透膜后, 用10 mg/L Hoechst 33342染色, 壓片后于熒光鏡(Nikon 70i)下觀察細胞核及GFP的分布與表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSA 處理對豬胎兒成纖維的影響

用0 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的TSA分別處理第3代胎兒成纖維細胞12 h、24 h、48 h、72 h、96 h, 取樣檢測細胞活率。結(jié)果如圖1所示。隨著TSA處理濃度的增大和處理時間的增長, 細胞活率都會出現(xiàn)顯著的下降。0.25 μmol/L TSA處理細胞24 h, 細胞活率不會出現(xiàn)顯著下降, 與對照組基本保持一致。

對不同濃度和時間TSA處理的細胞進行形態(tài)學(xué)觀察, 結(jié)果如圖2所示。0.25 μmol/L TSA處理成纖維細胞24 h后, 細胞形態(tài)與正常細胞相同, 沒有出現(xiàn)異常形態(tài)的細胞, 但是隨著處理濃度的增加和處理時間的增長, 細胞會出現(xiàn)變長、膨脹和貼壁力下降等現(xiàn)象。

2.2 TSA 處理對轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞中外源基因

表達的影響

TSA 處理對轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞中外源基因表達的影響如圖3所示。與對照組相比, 0.25 μmol/L TSA處理GFP轉(zhuǎn)基因細胞24 h后, GFP表達明顯增強, GFP陽性細胞數(shù)也顯著增加。為了更精確的確定GFP陽性細胞的比例, 用流式細胞儀對處理和未處理組進行了檢測, 結(jié)果如圖4所示, 經(jīng)TSA處理后, GFP陽性細胞數(shù)較未處理組增加近一倍。

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第33卷

圖1 TSA對豬成纖維細胞活率的影響

A: 不同處理濃度和處理時間的TSA對豬成纖維細胞活率的影響; B: CASY I細胞活率分析儀檢測圖例。

圖2 TSA對豬成纖維細胞形態(tài)的影響(×400)

A: 0 μmol/L (對照)TSA處理對豬成纖維細胞形態(tài)的影響; B: 0.25 μmol/L 24h TSA處理對豬成纖維細胞形態(tài)的影響; C: 0.5 μmol/L 12h TSA處理對豬成纖維細胞形態(tài)的影響; 箭頭所指為形態(tài)異常的細胞。

2.3 不同濃度TSA處理對克隆胚胎體外發(fā)育的影響

采用豬胎兒成纖維細胞作為供體細胞, 在核移

表1所示。隨著處理濃度的升高, 卵裂率并沒有顯著的變化; 囊胚率則隨著處理濃度的升高, 呈現(xiàn)出

, 最適的處理濃度為40 nmol/L, 植胚胎激活后, 分別用0 nmol/L、20 nmol/L、 先升高后降低的趨勢

此時的囊胚率顯著高于其他處理組和對照組40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L的TSA處理24 h, 檢測胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細胞數(shù), 結(jié)果如

(P<0.05), 囊胚細胞數(shù)也顯著高于對照組(P<0.05)。

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