本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因的遺傳表達(dá)及其抗病性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

好

9期　　　　　　　　　　　　杜建中,等:轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因的遺傳表達(dá)及其抗病性研究1721

率高達(dá)50%以上,損失極為嚴(yán)重[3].因此有效的病害防治與抗病育種工作就顯得日益迫切和重要.

植物基因工程拓寬了植物可利用的基因庫,為創(chuàng)造新種質(zhì)資源、培育植物新物種開辟了新的技術(shù)路線[4].目前轉(zhuǎn)基因在200多種植物上獲得成功,有3000多例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn)[5].2006年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達(dá)2520萬hm2,我國轉(zhuǎn)基因作物的面積也有350萬hm2[6].轉(zhuǎn)基因玉米抗性品種的選育和種植取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益.

幾丁質(zhì)是大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的組分,而植物體內(nèi)不存在.組分幾丁質(zhì),,.

自1986年P(guān)owell等次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得抗TMV的煙草植株以來,植物抗病基因工程取得了很大進(jìn)展.1986年Schlumbaum等[7]發(fā)現(xiàn)提純的菜豆幾丁質(zhì)

研究所段運(yùn)平提供.ELISA分析用的第一抗體是幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)產(chǎn)物的兔抗血清,第二抗體是堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔血清,均來自山西大學(xué)生物技術(shù)研究所梁愛華實(shí)驗(yàn)室.抗病鑒定所用病菌采自發(fā)病的田間植株,由本實(shí)驗(yàn)室采集保存.

1.1.2　轉(zhuǎn)化質(zhì)粒圖譜　轉(zhuǎn)化玉米自交系‘海9221’

的質(zhì)粒pGLⅡ2RC21(圖1)由美國堪薩斯州立大學(xué)Muthkrishnan教授提供.其攜帶有幾丁質(zhì)酶基因和

潮霉素抗性基因

,農(nóng)桿菌菌株為LBA4404.

圖1　質(zhì)粒pGLⅡ2RC21結(jié)構(gòu)圖

Fig.1　StructureofplasmidpGLⅡ2RC21

1.2　方　法

1.2.1　轉(zhuǎn)化方法　玉米5月初播種,7月中旬開

花,在開花期首先將待轉(zhuǎn)化處理的植株套袋(雌、雄花).第2天早晨收集0.2g左右新鮮花粉,并與10μg質(zhì)粒DNA混合于20mL的5%蔗糖溶液中,含花粉蔗糖溶液在與質(zhì)粒DNA(堿解法制備[14],并用PCRFragmentRecoveryKit純化質(zhì)粒DNA)混合

酶具有抗真菌活性.Broglie等[8]用從菜豆中分離到的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化煙草,首次獲得了抗立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的轉(zhuǎn)基因煙草植株.劉偉華等[9]將菜豆幾丁質(zhì)酶基因?qū)胄←溣着哂鷤M織,轉(zhuǎn)基因植株感白粉病癥狀減緩,同時(shí)還獲得1株赤霉菌接種未擴(kuò)展的轉(zhuǎn)基因T1植株.張志忠等[10]將番茄幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入西瓜中,獲得了對(duì)枯萎病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體.王景雪等[11]、杜春芳等[12]利用花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗衩缀陀筒?皆獲得了轉(zhuǎn)基因植株.

有關(guān)幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)化植物獲得抗病植株的研究已有不少報(bào)道,但直到目前還未見有關(guān)幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)化玉米植株后對(duì)諸如玉米絲黑穗病等真菌病害產(chǎn)生抗性的研究和報(bào)道.本研究采用花粉介導(dǎo)法[13]將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗衩鬃越幌怠?221’.在得到轉(zhuǎn)基因株系的基礎(chǔ)上,連續(xù)數(shù)年通過分子檢測(cè)、田間抗病鑒定、農(nóng)藝性狀篩選等,獲得了目的基因能穩(wěn)定遺傳表達(dá)、高抗病和其它農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系.

前后分別用超聲波(超聲波細(xì)胞粉碎儀,寧波新芝)處理溶液.超聲波處理參數(shù)為:超聲波強(qiáng)度350W,處理10次,每次6s,間隔10s.收集處理后的花粉并授粉于預(yù)先用剪刀切剪過的花絲上,成熟期收獲T0種子.

1.2.2　抗病株系的篩選及檢測(cè)過程　(1)潮霉素抗

性篩選　T0代種子用0.1%氯化汞溶液表面消毒13min,無菌水漂洗3～5次,然后播種在含潮霉素(15mg!L-1)的無菌沙土中發(fā)芽.隔1天澆1次含

有15mg!L-1潮霉素的水溶液,2周后觀察并記錄

觀察結(jié)果.將潮霉素抗性篩選得到的抗性苗(疑似轉(zhuǎn)化苗,T1代)移栽到大田,移栽時(shí)用1%絲軸黑粉菌菌土覆蓋苗根部,以作抗病鑒定.T1代植株長到5～6葉時(shí)取幼嫩葉片提取植物總DNA,以質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照,非轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照,進(jìn)行PCR檢測(cè)和Southernblot分析.根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,將含有目的基因(有特異擴(kuò)增帶或特異雜交帶)植株自

1　材料和方法

1.1　材　料

1.1.1　植物材料及抗體來源　選用配合力高、適宜

交授粉,收獲T1代種子.再根據(jù)田間抗病鑒定結(jié)

果,選擇發(fā)病率低的T1代種子播種(播種時(shí)用1%菌土覆蓋種子).依次類推得到T2代和T3代種子.

(2)PCR檢測(cè)　取大田植株5～6葉期幼嫩葉

推廣并被廣泛用于玉米雜交種生產(chǎn)但不抗絲黑穗病

的玉米自交系‘海9221’,由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物

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