本文選題：柔嫩艾美耳球蟲 + cDNA-SRAP　； 參考：《西南大學》2016年碩士論文

【摘要】：球蟲病是集約化養(yǎng)雞業(yè)最為高發(fā)且危害嚴重的一類寄生蟲病,在我國發(fā)病率較高,經濟損失巨大,其中柔嫩艾美耳球蟲為危害最強最嚴重的蟲種。盡管近年來對球蟲免疫學研究越來越深入,但由于球蟲復雜的生活史,龐大的基因組等問題,導致現階段對球蟲入侵和宿主防御的分子機制還不明確,感染引起宿主基因的表達變化也不清楚。本研究通過c DNA-SRAP技術篩選和分析與E.tenella感染相關基因,加強對E.tenella和宿主之間相互作用的研究,為從轉錄組水平上揭示E.tenella與宿主間的相互作用規(guī)律奠定基礎。主要研究結果如下:(1)雛雞脾臟RNA樣本的c DNA-SRAP體系的建立。用Trizol法提取14日齡雛雞脾臟總RNA,采用SMART Scribe Reverse Transcriptase試劑盒進行反轉錄,以脾臟c DNA為模板,以單因素試驗設計和正交試驗設計對c DNA-SRAP反應體系進行優(yōu)化,獲得最佳反應體系和擴增程序。反應體系為:d NTPs:0.25m M;Mg2+:2.0m M;Taq聚合酶:2.25U;引物:0.55μM;模板c DNA:20ng。擴增程序為:94℃預變性5min,94℃變性1min,36℃退火1min,72℃延伸1min,共5個循環(huán),94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環(huán),72℃延伸10min。利用優(yōu)化好的程序和體系進行c DNA-SRAP擴增,能夠獲得條帶清晰、多態(tài)性好的擴增條帶。(2)E.tenella感染雛雞脾臟轉錄組c DNA-SRAP分析。以雛雞脾臟c DNA為模板,采用最優(yōu)擴增體系及程序,通過256對c DNA-SRAP任意引物對感染組和對照組進行擴增,經1.6%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析,對差異顯著的條帶進行回收。初次篩選后感染組共獲得12個上調表達基因,通過動物實驗和c DNA-SRAP對該12個基因進行驗證后,經過二次PCR、克隆測序后共獲得9個基因序列。在NCBI中通過BLAST-N工具進行在線比對,結果顯示9個基因均有高度同源性序列,其中6個為已知功能基因,分別為MLL5蛋白基因(XM_003640341.2)、嘌呤受體P2RY8基因(XM_011588440.1)、磷脂酶PLCD1基因(XM_004939119.2)、亮氨酸氨基肽酶LAP3基因(XM_010220558.1)、IL-17 RA基因(XM_013172986.1)、Wolf-Hirschhom畸變綜合征的候選相關基因WHSC1L1基因(XM_015297415.1)。(3)E.tenella感染雛雞脾臟差異表達基因定量分析。對6個功能基因設計特異性引物,采用SYBR Green I法進行Real time RT-PCR定量分析。結果表明感染E.tenenlla后,MLL5基因上調表達1.52倍、P2RY8基因上調表達2.33倍、PLCD1基因上調表達1.48倍、LAP3基因上調表達1.57倍、IL-17RA基因上調表達1.41倍、WHSC1L1基因上調表達1.73倍。對數據進行獨立樣本T檢驗顯著性分析,其中P2RY8、WHSC1L1基因為極顯著差異(P0.01),MLL5、PLCD1、LAP3、IL-17 RA為顯著差異(P0.05)。E.tenella感染雛雞能夠引起脾臟中MLL5、P2RY8、PLCD1、LAP3、IL-17RA和WHSC1L1基因的上調,表明在E.tenella感染宿主早期,上述基因發(fā)生表達變化可能與E.tenella入侵宿主以及宿主的防御機制相關。PLCD1能夠放大Ca2+信號調節(jié)途徑,參與固有免疫反應,LAP3幫助抗原肽在膜表面形成MHCI類分子復合物,IL-17RA作為細胞因子受體參與炎癥反應過程,三個基因具有的免疫學功能預示其表達變化可能與球蟲感染引起的免疫反應相關;MLL5基因具有促進細胞增殖的作用,WHSC1L1基因多與癌癥發(fā)展過程相關,P2RY8基因具體功能還不太明確,三者同球蟲感染相關作用機制仍然需要進一步研究。
[Abstract]:Coccidiosis is the most frequent and serious harm parasitic diseases in intensive poultry industry, in China's high incidence of huge economic losses, the Eimeria species is the most serious harm to the strongest. Although in recent years, more and more in-depth research on coccidia immunology, but due to the complex life history of coccidia, genome such a large problem, leading to the molecular mechanism at the present stage of invasion and host defense is not clear, infection caused by expression of host genes is not clear. This study by C DNA-SRAP and E.tenella infection screening and analysis of related genes, strengthen the research on the interaction between E.tenella and host, lay a foundation for revealing each other interaction between E.tenella and the host from the transcriptome level. The main results are as follows: (1) the establishment of RNA C DNA-SRAP chicken spleen samples from 14 days of age. The system with Trizol method Chicken spleen total RNA, reverse transcription using SMART Scribe Reverse Transcriptase kit, C DNA in spleen of C as template, DNA-SRAP reaction system was optimized by single factor test and orthogonal test, the best reaction system and PCR procedure. The reaction system is: D NTPs:0.25m M; Mg2+: 2.0m M; Taq polymerase primer: 2.25U; 0.55 M; C template DNA:20ng. amplification procedure: 94 C predegeneration 5min 94 C 1min 1min degeneration, annealed at 36 C, 72 C extension 1min, a total of 5 cycles, 94 degrees degeneration 1min, annealed at 55 C 1min, 72 C extension 1min, a total of 35 cycles, 72 degrees extension 10min. C DNA-SRAP by using the optimization procedure and the system can get clear bands, amplified bands with high polymorphism. (2) E.tenella chickens infected C DNA-SRAP spleen transcriptome analysis. In chicken spleen C DNA as template, using the optimal amplification system and procedures, by 256 to C DNA- SRAP arbitrary primers of infection group and control group were analyzed by 1.6% agarose gel electrophoresis and UV, the difference bands were recovered. There were 12 up-regulated genes were infected after screening for the first time, 12 genes were verified by animal experiment and C DNA-SRAP, after two times of PCR, 9 gene sequences were cloned and sequenced. The BLAST-N tool for online comparison in NCBI, the results showed that 9 genes were highly homologous sequences, including 6 known genes, including MLL5 protein gene (XM_003640341.2), purine receptor P2RY8 gene (XM_011588440.1), phospholipase PLCD1 gene (XM_004939119.2), leucine aminopeptidase LAP3 gene (XM_010220558.1), IL-17 RA (XM_013172986.1) gene, a candidate gene for WHSC1L1 Wolf-Hirschhom gene aberration syndrome (XM_015297415.1). (3) E.tenella infected chicken spleen Quantitative analysis of gene expression difference. Dirty on the 6 functional gene specific primers were designed for Real time RT-PCR SYBR Green I by quantitative analysis method. The results showed that after E.tenenlla infection, MLL5 gene expression up-regulated P2RY8 gene expression by 1.52 times, 2.33 times, 1.48 times up-regulated PLCD1 gene expression, LAP3 gene expression in 1.57 times, IL-17RA the gene expression of 1.41 times, 1.73 times. The WHSC1L1 gene expression was analyzed by independent sample T test were analyzed, the data including P2RY8, WHSC1L1 gene was significant difference (P0.01), MLL5, PLCD1, LAP3, IL-17, RA were significant difference (P0.05).E.tenella infection in chickens can cause spleen MLL5, P2RY8, PLCD1. LAP3, IL-17RA and WHSC1L1 genes up-regulated in E.tenella showed that the early infection of the host, the gene expression changes of E.tenella and invasion of host and host defense mechanisms related to amplify Ca2+.PLCD1 Signal pathway, involved in innate immune responses, LAP3 help MHCI antigen peptide to form molecular complexes on the membrane surface, IL-17RA as a cytokine receptor involved in inflammatory reaction, immunological function of three genes has indicated its expression may be associated with the immune response induced by Eimeria infection; MLL5 gene can promote cell proliferation, WHSC1L1 genes associated with cancer progression, P2RY8 gene specific function is not clear, the three with the coccidial infection mechanism still needs further study.

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

【相似文獻】

相關期刊論文 前7條

1 張冬杰;;維生素C對視黃酸受體β基因的調控[J];湖北農業(yè)科學;2009年03期

2 齊幫若;李慶章;;光照對小鼠下丘腦視上核及乳腺組織鐘基因Clock表達的影響[J];東北農業(yè)大學學報;2012年09期

3 趙蘭;徐鵬;孫效文;;碳酸鹽堿度脅迫下鯉魚氨排泄相關基因的差異表達[J];生物技術通報;2013年04期

4 蔣瑤;戚曉利;唐芳;趙樹堂;陳軍;盧孟柱;;利用基因芯片篩選影響莖分化的相關基因[J];林業(yè)科學;2012年11期

5 魏平;張軍科;;低濃度SA誘導桃葉片PGIP基因的表達變化[J];北方園藝;2011年17期

6 王小海;楊力俠;吳勇延;杜娟;唐波;郭澤坤;;小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新轉錄本功能分析[J];農業(yè)生物技術學報;2012年07期

7 ;[J];;年期

相關會議論文 前8條

1 李勇;趙如冰;陳星;;同型半胱氨酸誘發(fā)體外培養(yǎng)大鼠胚胎基因表達變化的基因芯片研究[A];中國毒理學會第三屆全國學術會議論文（摘要）集[C];2001年

2 張家平;黃躍生;楊宗城;;燒傷早期心肌組織幾種炎癥相關基因表達變化的實驗研究[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會論文匯編[C];2004年

3 伍亞民;劉媛;王正國;;Hes基因在神經干細胞發(fā)育中的作用[A];“基因、進化與生理功能多樣性”海內外學術研討會暨中國生理學會第七屆比較生理學學術會議論文摘要[C];2009年

4 馬慧敏;呂曉迎;陸慧琴;;基于GenMAPP的Ni~(2+)表達譜芯片實驗差異表達基因的功能路徑分析[A];中國生物醫(yī)學工程進展——2007中國生物醫(yī)學工程聯(lián)合學術年會論文集（下冊）[C];2007年

5 張繼紅;梁力建;黃潔夫;;Fas基因表達變化在Genistein抑制肝癌增長中的作用[A];第十二屆全國肝癌學術會議論文匯編[C];2009年

6 李玲;鄔利婭-伊明;趙蕾;于永生;李冬潔;蘇定馮;;RAS各組份的基因在SHR心、腎、主動脈中的表達及其意義[A];第九屆全國心血管藥理學術會議論文集[C];2007年

7 朱瑩瑩;倪道鳳;許彩民;;AD模型大鼠嗅球組織基因表達變化的篩選及目的基因的驗證[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（下）[C];2007年

8 黃文芳;楊永長;劉華;曾婭莉;周定安;胥國強;劉文;;基因芯片技術篩選辛伐他汀作用K562細胞的差異表達基因[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

相關重要報紙文章 前3條

1 衣曉峰;哈醫(yī)大一院系列研究阿爾茨海默病關聯(lián)基因[N];中國醫(yī)藥報;2007年

2 楊駿;肥胖可能與炎癥基因有關[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

3 通訊員 蔡心軼 記者 程守勤;哪些人體基因易受PM2.5影響[N];健康報;2014年

相關博士學位論文 前10條

1 陳紅艷;刺槐中參與共生固氮的結瘤相關基因的分離鑒定和功能分析[D];西北農林科技大學;2015年

2 董燕妮;擬南芥和油菜磷脂酶基因pPLAIIIδ的功能分析[D];華中農業(yè)大學;2015年

3 任艷萍;轉PRL基因小鼠模型的構建與Stat5a的乳腺發(fā)育調控機理研究[D];廣西大學;2014年

4 施堯;枯草桿菌蛋白酶基因6在須癬毛癬菌致病性中的功能研究[D];中國農業(yè)大學;2015年

5 吳幼容;觀音竹鹽脅迫的生理響應與基因表達分析[D];福建農林大學;2012年

6 張靜思;基于基因芯片和生物學分析技術對血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓急性腎臟損傷相關基因的研究[D];大連醫(yī)科大學;2015年

7 訾臣;miRNAs對斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調控作用及機制分析[D];揚州大學;2015年

8 谷溪;miR-124a促進神經突起生長靶基因及其作用機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

9 張亮;擬南芥Athspr新基因的抗鹽性及表達調控研究[D];蘭州大學;2014年

10 王海飛;豬外周血單核細胞抗病毒反應的轉錄組及全基因組DNA甲基化調控研究[D];中國農業(yè)大學;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 李紫薇;蒺藜苜蓿E2F/DP基因鑒定及鹽脅迫表達分析[D];東北林業(yè)大學;2015年

2 栗振義;紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析[D];中國農業(yè)科學院;2015年

3 陳凱麗;綿羊SPLUNC1基因的克隆、表達及活性檢測[D];石河子大學;2015年

4 翟曼君;雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡相關基因的功能研究[D];石河子大學;2015年

5 宋穎;黃鱔性別相關基因在不同組織甲基化的分析[D];南京農業(yè)大學;2014年

6 李欣鈺;鵝FSH基因的克隆及表達初步分析[D];江西農業(yè)大學;2013年

7 李孝鑫;輻射敏感基因作為潛在生物劑量計的實驗研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

8 王雨田;Prdm14基因在豬早期胚胎中的表達及作用研究[D];吉林大學;2016年

9 付偉;藏系綿羊MSX2基因皮膚特異表達載體構建及功能分析[D];西南民族大學;2015年

10 周晏丞;E.tenella感染雛雞脾臟差異表達基因的cDNA-SRAP分析[D];西南大學;2016年

，

本文編號：1749277