發(fā)布時(shí)間：2018-04-14 12:17

  本文選題：柔嫩艾美耳球蟲 + cDNA-SRAP　； 參考：《西南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：球蟲病是集約化養(yǎng)雞業(yè)最為高發(fā)且危害嚴(yán)重的一類寄生蟲病,在我國發(fā)病率較高,經(jīng)濟(jì)損失巨大,其中柔嫩艾美耳球蟲為危害最強(qiáng)最嚴(yán)重的蟲種。盡管近年來對(duì)球蟲免疫學(xué)研究越來越深入,但由于球蟲復(fù)雜的生活史,龐大的基因組等問題,導(dǎo)致現(xiàn)階段對(duì)球蟲入侵和宿主防御的分子機(jī)制還不明確,感染引起宿主基因的表達(dá)變化也不清楚。本研究通過c DNA-SRAP技術(shù)篩選和分析與E.tenella感染相關(guān)基因,加強(qiáng)對(duì)E.tenella和宿主之間相互作用的研究,為從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示E.tenella與宿主間的相互作用規(guī)律奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)雛雞脾臟RNA樣本的c DNA-SRAP體系的建立。用Trizol法提取14日齡雛雞脾臟總RNA,采用SMART Scribe Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以脾臟c DNA為模板,以單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)c DNA-SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,獲得最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。反應(yīng)體系為:d NTPs:0.25m M;Mg2+:2.0m M;Taq聚合酶:2.25U;引物:0.55μM;模板c DNA:20ng。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,36℃退火1min,72℃延伸1min,共5個(gè)循環(huán),94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸10min。利用優(yōu)化好的程序和體系進(jìn)行c DNA-SRAP擴(kuò)增,能夠獲得條帶清晰、多態(tài)性好的擴(kuò)增條帶。(2)E.tenella感染雛雞脾臟轉(zhuǎn)錄組c DNA-SRAP分析。以雛雞脾臟c DNA為模板,采用最優(yōu)擴(kuò)增體系及程序,通過256對(duì)c DNA-SRAP任意引物對(duì)感染組和對(duì)照組進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析,對(duì)差異顯著的條帶進(jìn)行回收。初次篩選后感染組共獲得12個(gè)上調(diào)表達(dá)基因,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和c DNA-SRAP對(duì)該12個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證后,經(jīng)過二次PCR、克隆測(cè)序后共獲得9個(gè)基因序列。在NCBI中通過BLAST-N工具進(jìn)行在線比對(duì),結(jié)果顯示9個(gè)基因均有高度同源性序列,其中6個(gè)為已知功能基因,分別為MLL5蛋白基因(XM_003640341.2)、嘌呤受體P2RY8基因(XM_011588440.1)、磷脂酶PLCD1基因(XM_004939119.2)、亮氨酸氨基肽酶LAP3基因(XM_010220558.1)、IL-17 RA基因(XM_013172986.1)、Wolf-Hirschhom畸變綜合征的候選相關(guān)基因WHSC1L1基因(XM_015297415.1)。(3)E.tenella感染雛雞脾臟差異表達(dá)基因定量分析。對(duì)6個(gè)功能基因設(shè)計(jì)特異性引物,采用SYBR Green I法進(jìn)行Real time RT-PCR定量分析。結(jié)果表明感染E.tenenlla后,MLL5基因上調(diào)表達(dá)1.52倍、P2RY8基因上調(diào)表達(dá)2.33倍、PLCD1基因上調(diào)表達(dá)1.48倍、LAP3基因上調(diào)表達(dá)1.57倍、IL-17RA基因上調(diào)表達(dá)1.41倍、WHSC1L1基因上調(diào)表達(dá)1.73倍。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)顯著性分析,其中P2RY8、WHSC1L1基因?yàn)闃O顯著差異(P0.01),MLL5、PLCD1、LAP3、IL-17 RA為顯著差異(P0.05)。E.tenella感染雛雞能夠引起脾臟中MLL5、P2RY8、PLCD1、LAP3、IL-17RA和WHSC1L1基因的上調(diào),表明在E.tenella感染宿主早期,上述基因發(fā)生表達(dá)變化可能與E.tenella入侵宿主以及宿主的防御機(jī)制相關(guān)。PLCD1能夠放大Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)途徑,參與固有免疫反應(yīng),LAP3幫助抗原肽在膜表面形成MHCI類分子復(fù)合物,IL-17RA作為細(xì)胞因子受體參與炎癥反應(yīng)過程,三個(gè)基因具有的免疫學(xué)功能預(yù)示其表達(dá)變化可能與球蟲感染引起的免疫反應(yīng)相關(guān);MLL5基因具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,WHSC1L1基因多與癌癥發(fā)展過程相關(guān),P2RY8基因具體功能還不太明確,三者同球蟲感染相關(guān)作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Coccidiosis is the most frequent and serious harm parasitic diseases in intensive poultry industry, in China's high incidence of huge economic losses, the Eimeria species is the most serious harm to the strongest. Although in recent years, more and more in-depth research on coccidia immunology, but due to the complex life history of coccidia, genome such a large problem, leading to the molecular mechanism at the present stage of invasion and host defense is not clear, infection caused by expression of host genes is not clear. This study by C DNA-SRAP and E.tenella infection screening and analysis of related genes, strengthen the research on the interaction between E.tenella and host, lay a foundation for revealing each other interaction between E.tenella and the host from the transcriptome level. The main results are as follows: (1) the establishment of RNA C DNA-SRAP chicken spleen samples from 14 days of age. The system with Trizol method Chicken spleen total RNA, reverse transcription using SMART Scribe Reverse Transcriptase kit, C DNA in spleen of C as template, DNA-SRAP reaction system was optimized by single factor test and orthogonal test, the best reaction system and PCR procedure. The reaction system is: D NTPs:0.25m M; Mg2+: 2.0m M; Taq polymerase primer: 2.25U; 0.55 M; C template DNA:20ng. amplification procedure: 94 C predegeneration 5min 94 C 1min 1min degeneration, annealed at 36 C, 72 C extension 1min, a total of 5 cycles, 94 degrees degeneration 1min, annealed at 55 C 1min, 72 C extension 1min, a total of 35 cycles, 72 degrees extension 10min. C DNA-SRAP by using the optimization procedure and the system can get clear bands, amplified bands with high polymorphism. (2) E.tenella chickens infected C DNA-SRAP spleen transcriptome analysis. In chicken spleen C DNA as template, using the optimal amplification system and procedures, by 256 to C DNA- SRAP arbitrary primers of infection group and control group were analyzed by 1.6% agarose gel electrophoresis and UV, the difference bands were recovered. There were 12 up-regulated genes were infected after screening for the first time, 12 genes were verified by animal experiment and C DNA-SRAP, after two times of PCR, 9 gene sequences were cloned and sequenced. The BLAST-N tool for online comparison in NCBI, the results showed that 9 genes were highly homologous sequences, including 6 known genes, including MLL5 protein gene (XM_003640341.2), purine receptor P2RY8 gene (XM_011588440.1), phospholipase PLCD1 gene (XM_004939119.2), leucine aminopeptidase LAP3 gene (XM_010220558.1), IL-17 RA (XM_013172986.1) gene, a candidate gene for WHSC1L1 Wolf-Hirschhom gene aberration syndrome (XM_015297415.1). (3) E.tenella infected chicken spleen Quantitative analysis of gene expression difference. Dirty on the 6 functional gene specific primers were designed for Real time RT-PCR SYBR Green I by quantitative analysis method. The results showed that after E.tenenlla infection, MLL5 gene expression up-regulated P2RY8 gene expression by 1.52 times, 2.33 times, 1.48 times up-regulated PLCD1 gene expression, LAP3 gene expression in 1.57 times, IL-17RA the gene expression of 1.41 times, 1.73 times. The WHSC1L1 gene expression was analyzed by independent sample T test were analyzed, the data including P2RY8, WHSC1L1 gene was significant difference (P0.01), MLL5, PLCD1, LAP3, IL-17, RA were significant difference (P0.05).E.tenella infection in chickens can cause spleen MLL5, P2RY8, PLCD1. LAP3, IL-17RA and WHSC1L1 genes up-regulated in E.tenella showed that the early infection of the host, the gene expression changes of E.tenella and invasion of host and host defense mechanisms related to amplify Ca2+.PLCD1 Signal pathway, involved in innate immune responses, LAP3 help MHCI antigen peptide to form molecular complexes on the membrane surface, IL-17RA as a cytokine receptor involved in inflammatory reaction, immunological function of three genes has indicated its expression may be associated with the immune response induced by Eimeria infection; MLL5 gene can promote cell proliferation, WHSC1L1 genes associated with cancer progression, P2RY8 gene specific function is not clear, the three with the coccidial infection mechanism still needs further study.

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：1749277