本文選題：海洛因 + 成癮�。� 參考：《寧波大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:藥物成癮作為一種慢性腦疾病,主要特征為失控性的強(qiáng)迫用藥和持久的藥物渴求。越來越多的證據(jù)表明,表觀遺傳學(xué)中非編碼RNA在調(diào)控藥物成癮中發(fā)揮著重要作用。海洛因成癮作為最常見的阿片類成癮之一,已成為我國主要的社會公共衛(wèi)生問題之一。為此,深入研究海洛因成癮和復(fù)吸的神經(jīng)分子生物學(xué)機(jī)制,探索與海洛因成癮的產(chǎn)生和發(fā)展過程中密切相關(guān)的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床價值。mi RNA是一類非編碼RNA,已被證實(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)中富集并參與調(diào)控大腦的神經(jīng)可塑性及突觸間遞質(zhì)的釋放,調(diào)控眾多涉及神經(jīng)可塑性和突觸功能基因的表達(dá)。因此,本研究主要探索mi R-181a在海洛因成癮和復(fù)吸中的表觀遺傳機(jī)制,將為海洛因成癮診斷和治療提供生物標(biāo)志物,并為復(fù)吸預(yù)防提供新思路和新手段。實(shí)驗(yàn)一、依據(jù)人體血漿mi RNA表達(dá)芯片對人類hsa-mi R-181a表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證方法:根據(jù)入選和排除標(biāo)準(zhǔn),收集合格健康對照者(Control,n=49)和海洛因成癮患者(Heroin addiction,n=53)的血漿樣本進(jìn)行mi RNA表達(dá)譜芯片分析。血漿提取RNA進(jìn)一步通過RT-PCR驗(yàn)證選定的mi RNA表達(dá)芯片結(jié)果。結(jié)果:Control組和Heroin addiction組樣本經(jīng)RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)血漿hsami R-181a表達(dá)水平Heroin addiction組顯著高于Control組中[t(100)=54.956,P0.001],RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與表達(dá)芯片基本一致。實(shí)驗(yàn)二、依據(jù)海洛因自身給藥大鼠NAc腦區(qū)mi RNA表達(dá)芯片對大鼠rnomi R-181a表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證方法:SD大鼠行頸靜脈插管手術(shù),恢復(fù)一周,進(jìn)行海洛因(0.2mg/ml)自身給藥訓(xùn)練,每天4h,持續(xù)14天,成功建立海洛因自身給藥大鼠穩(wěn)定模型后,海洛因自身給藥大鼠戒斷1天和14天后,用條件線索誘導(dǎo)進(jìn)行海洛因復(fù)吸行為測試2h,隨機(jī)分為戒斷1天條件線索誘導(dǎo)組(CS1,n=8),戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(CS14,n=8),同時用生理鹽水代替海洛因進(jìn)行大鼠自身給藥訓(xùn)練,設(shè)立生理鹽水對照組(Control,n=7),海洛因自身給藥大鼠條件線索誘導(dǎo)測試后麻醉斷頭取NAc腦區(qū)并提取RNA,RT-PCR驗(yàn)證選定的mi RNA芯片結(jié)果。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證,上述三組間的mi R-181a表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[F(2,11)=4.074,P=0.047]。LSD法比較發(fā)現(xiàn),CS1組與Control組相比,mi R-181a表達(dá)有增加趨勢,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而CS14組與CS1組相比,mi R-181a表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),同時CS14組與Control組相比,mi R-181a表達(dá)有降低趨勢,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與mi RNAs芯片表達(dá)基本一致。實(shí)驗(yàn)三:雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證rno-mi R-181a對靶基因Me CP2表達(dá)的影響方法:根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫Target Scan預(yù)測到mi R-181a與靶基因Me CP2的結(jié)合點(diǎn),構(gòu)建Me CP2-WT野生質(zhì)粒與Me CP2-MU突變質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染mi R-181a質(zhì)粒與mi R-181a空載質(zhì)粒于293T細(xì)胞,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h后使用DualLuciferase Reporter Assay System測定各組報(bào)告基因的熒光表達(dá)量,觀察mi RNA對Me CP2是否有直接抑制作用。結(jié)果:根據(jù)Dual-Luciferase Reporter Assay System測定分析,發(fā)現(xiàn)Me CP2基因表達(dá)水平在Me CP2-WT+mi R-181a組顯著低于Me CP2-WT-NC+mi R-181a組[t(4)=11.480,P=3.28×10-4],同時Me CP2-WT+mi R-181a組顯著低于Me CP2-WT+mi R-181a-NC組[t(4)=3.645,P=0.022]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rno-mi R-181a能與靶基因Me CP2的3'UTR直接結(jié)合,并抑制Me CP2基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)四:檢測海洛因自身給藥大鼠條件線索誘導(dǎo)復(fù)吸后靶基因Me CP2蛋白表達(dá)的變化方法:成功建立海洛因自身給藥大鼠穩(wěn)定模型后,隨機(jī)分為戒斷1天條件線索誘導(dǎo)組(CS1,n=8),戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(CS14,n=8),并用海洛因條件線索誘導(dǎo)2h后立即麻醉斷頭取NAc腦區(qū),并用生理鹽水代替海洛因設(shè)立生理鹽水對照組(Control,n=7),用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測Me CP2變化。結(jié)果:經(jīng)Western blot檢測分析,Control組、CS1組、CS14組Me CP2蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[F(2,6)=34.467,P=5.13×10-4],LSD法比較發(fā)現(xiàn),CS14組與Control組及CS1組相比,CS14組Me CP2蛋白表達(dá)均顯著升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)五:檢測海洛因自身給藥大鼠NAc腦區(qū)過表達(dá)rno-mi R-181a后Me CP2m RNA及Me CP2蛋白水平變化方法:成功建立海洛因自身給藥大鼠模型,隨機(jī)分為mi R-181a過表達(dá)戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(LV-mi R-181a,n=8),rno-mi R-181a陰性病毒戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(LV-GFP,n=8),設(shè)立戒斷14天條件線索誘導(dǎo)對照組(CS14,n=8)。利用腦立體微量注射法對LV-mi R-181a組與LV-GFP組大鼠NAc腦區(qū)進(jìn)行慢病毒注射,病毒在腦內(nèi)轉(zhuǎn)染2周后進(jìn)行2h海洛因條件線索誘導(dǎo)復(fù)吸測試,然后麻醉斷頭取NAc腦區(qū)。用RT-PCR檢測靶基因Me CP2m RNA表達(dá)變化,Western blot檢測Me CP2蛋白變化。結(jié)果:1、經(jīng)RT-PCR檢測靶基因Me CP2m RNA表達(dá)變化,LV-mi R-181a組(n=5),LV-GFP組(n=5),CS14組(n=5),經(jīng)RT-PCR檢測,在NAc腦區(qū)過表達(dá)rno-mi R-181a后靶基因Me CP2m RNA表達(dá)降低,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[F(2,12)=0.500,P=0.618]。2、經(jīng)Western blot檢測顯示,經(jīng)LV-mi R-181a后,Me CP2表達(dá)變化顯著降低[F(2,6)=41.008,P=3.17×10-4]。LSD法兩兩比較發(fā)現(xiàn),LV-mi R-181a組分別與CS14組及LV-GFP組相比表達(dá)均降低,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)六:觀察海洛因自身給藥大鼠NAc腦區(qū)過表達(dá)rno-mi R-181a后條件線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸行為變化方法:成功建立海洛因自身給藥大鼠模型,隨機(jī)分為rno-mi R-181a過表達(dá)戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(LV-mi R-181a,n=8),rno-mi R-181a陰性病毒戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(LV-GFP,n=8),戒斷14天條件線索誘導(dǎo)組(CS14,n=8),利用腦立體微量注射法對LV-mi R-181a組與LV-GFP組大鼠NAc腦區(qū)進(jìn)行慢病毒注射,病毒在腦內(nèi)轉(zhuǎn)染2周后進(jìn)行2h海洛因條件線索誘導(dǎo)測試。結(jié)果:經(jīng)條件線索誘導(dǎo)2h復(fù)吸測試,上述三組間,條件線索誘導(dǎo)復(fù)吸行為存在顯著差異[F(2,21)=7.559,P=0.03]。LSD法比較發(fā)現(xiàn),LV-mi R-181a組分別與LV-GFP組及CS14組相比,條件線索誘導(dǎo)的復(fù)吸行為均顯著減低(P0.05)。實(shí)驗(yàn)表明NAc腦區(qū)過表達(dá)mi R-181a后能顯著抑制大鼠條件線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為。實(shí)驗(yàn)七:觀察海洛因自身給藥大鼠NAc腦區(qū)注射LV-si RNA-Me CP2后對復(fù)吸行為的干預(yù)作用及其對基因Me CP2表達(dá)的影響方法:成功建立海洛因自身給藥大鼠模型后,隨機(jī)分為LV-si RNA-Me CP2組(n=8),LV-GFP組(n=8),CS14對照組(n=8)。利用腦立體定位微量注射法注射慢病毒,轉(zhuǎn)染2周后進(jìn)行2h條件線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸行為測試。RTPCR檢測Me CP2m RNA表達(dá)變化,Western blot驗(yàn)證Me CP2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1、經(jīng)條件線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸行為測試,LV-si RNA-Me CP2組分別與LV-GFP及CS14組相比,條件線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸行為顯著減低[F(2,21)=3.851,P=0.038]。2、經(jīng)RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)Me CP2m RNA在各組間存在顯著差異[F(2,12)=4.302,P=0.039]。LSD法比較發(fā)現(xiàn),LV-si RNA-Me CP2組分別與LV-GFP及CS14組相比,Me CP2m RNA表達(dá)均降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3、經(jīng)Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)Me CP2蛋白表達(dá)水平在CS14組(n=3),LV-GFP組(n=3)和LV-si RNA-Me CP2組(n=3)。三組間Me CP2蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異[F(2,6)=43.717,P=2.65×10-4]。LSD法比較發(fā)現(xiàn),LVsi RNA-Me CP2組分別與LV-si RNA-Me CP2組及CS14組相比,Me CP2蛋白表達(dá)均顯著性降低(P0.01)。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,外周血漿hsa-mi R-181a水平海洛因成癮者高于正常人。同時海洛因自身給藥大鼠模型中,與生理鹽水對照組比較,海洛因成癮大鼠在戒斷1天后NAc腦區(qū)mi R-181a有增加趨勢,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在戒斷14天后條件線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸大鼠NAc腦區(qū)mi R-181a顯著降低(P0.05)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在海洛因自身給藥大鼠NAc腦區(qū)過表達(dá)rno-mi R-181a能顯著抑制海洛因自身給藥大鼠戒斷后線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為,并通過數(shù)據(jù)庫與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了rno-mi R-181a能直接作用于靶基因Me CP23'UTR而抑制Me CP2基因,同時用LV-si RNA-Me CP2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明減少NAc腦區(qū)Me CP2蛋白能顯著抑制自身給藥大鼠戒斷后海洛因復(fù)吸行為的恢復(fù)。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果所述,初步闡明了非編碼mi R-181a調(diào)控靶基因Me CP2在海洛因成癮和復(fù)吸中的表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制,并為臨床海洛因成癮和復(fù)吸的預(yù)防和治療提供新的生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1745500