本文選題：CRISPR-Cas系統(tǒng) + CYP105　； 參考：《安徽大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomycesvirginiae IBL14)是一株從甾體藥物制藥廠排污池土壤中分離得到的放線菌。該菌株能在多種留醇類化合物(包括薯蕷皂素、雌二醇、去氧皮質(zhì)酮、膽固醇、麥角固醇等)為唯一碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行生長,并且能通過次級(jí)代謝產(chǎn)生多種新的甾醇類化合物。為系統(tǒng)闡明該菌株CPY在復(fù)雜的次級(jí)代謝過程中的功能與機(jī)理,實(shí)驗(yàn)室已對(duì)S.virginiaeIBL14進(jìn)行了全基因組測(cè)序,并利用G0、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG等數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因分析與功能注釋。本論文旨在對(duì)該染色體中的CYP105家族基因進(jìn)行信息學(xué)分析預(yù)測(cè)、基因敲除、蛋白表達(dá)、生物轉(zhuǎn)化及結(jié)構(gòu)與功能分析。S.virginniae IBL14全基因組的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):該菌株含有31個(gè)CYP450 基因,其中:svh001、svu001、svu003、svu004、sVu005 為 CYP105 家族基因,svh001、svu003、svu004具有極高的同源性,其二級(jí)結(jié)構(gòu)基本相同,推測(cè)三個(gè)基因在結(jié)構(gòu)和功能上是極其保守的,可能具有類似的功能。sVu005基因和svh001、svu003、sVu004具有一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異。svu001其氨基酸和其它CYP105同源性較低,但在二維結(jié)構(gòu)上,和其他CYP105家族基因沒有明顯區(qū)別,均含有13個(gè)α超螺旋結(jié)構(gòu);svu001和其它CYP105家族基因二維結(jié)構(gòu)主要的區(qū)別在于其α螺旋均比同家族基因長,導(dǎo)致其蛋白總長高達(dá)499個(gè)AA(一般為400個(gè)左右)。在CYP105家族基因的五個(gè)基因中,均發(fā)現(xiàn)了 K-helix和Heme binding motif 保守基序。svh001、svu003、svu004、svu005 的 Heme binding motif 極為保守,尤其是svu003、svu004的Heme binding motif完全一致;但與svu001的Heme binding motif有極大的差異。這五個(gè)基因的K-helix基序基本一致。而所有CYP家族中被認(rèn)為是一個(gè)保守的I-helix基序,卻未在svu001發(fā)現(xiàn)。通過基因注釋、序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析,我們確定svh001、svu003、svu004為CYP105C1;svu005為CYP105D1;svu00l因具有不同尋常的特征,認(rèn)為其為CYP105家族中的一個(gè)新的亞家族或者是一個(gè)新的家族基因。全基因組的生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn):S.virginiae IBL14基因組存在著一個(gè)CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)。對(duì)該系統(tǒng)Cas蛋白的組成及排列結(jié)構(gòu)分析,我們將其命名其為Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明該系統(tǒng)能高效的對(duì)自身基因組中的基因進(jìn)行編輯;特別是應(yīng)用該系統(tǒng)開發(fā)的基因編輯工具可對(duì)其它生物進(jìn)行有效的基因編輯,具有替代目前商用的Cas9基因編輯系統(tǒng)的潛力。實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了包含編輯模板片段(templet DNA/t-DNA)和靶向基因片段(guide DNA/g-DNA)的基因編輯質(zhì)粒(gene editing plasmid),并將其轉(zhuǎn)化到S.virginiae IBL14原生質(zhì)體中,篩選得到上述5個(gè)CYP105家族基因敲除的轉(zhuǎn)化子。結(jié)合唯一碳源生長、生理形態(tài)分析、生物信息學(xué)分析等方法研究了CYP105家族基因?qū).virginiae IBL14生理功能的影響,結(jié)果表明:1)Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以成功對(duì)該基因組內(nèi)源基因進(jìn)行編輯,其操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高;2)CYP105家族基因的單敲除不致死,但會(huì)明顯影響菌體的生長和生理變化,其中IBL14Asvu004在液體和固體培養(yǎng)時(shí)大量產(chǎn)生胞內(nèi)色素,并且在液體培養(yǎng)時(shí)不形成菌絲球;3)S.virginiea IBL14復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物可以有效地抑制細(xì)菌和真菌的生長;4)CYP105基因的敲除通過影響聚酮的代謝途徑顯著影響IBL14的抗生素和抗真菌素的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)將CYP105家族基因在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了克隆,優(yōu)化了發(fā)酵條件,實(shí)現(xiàn)了可溶性的外源表達(dá)。并以多種留醇類化合物作為底物,進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化功能分析。試驗(yàn)表明:(1)svh001具有多種甾醇類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化功能:輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-羥基-維生素D3,輕化16,17環(huán)氧黃體酮生成新的輕化產(chǎn)物。(2)svu001可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-輕基維生素D3,其所在基因簇與精氨酸代謝途徑相關(guān),可以羥化精氨酸為N-ω-羥基-精氨酸。(3)svu003可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-羥基-維生素D3。(4)svu004可以輕化雌二醇生成雌三醇和2要基雌二醇,輕化維生素D3生成25.輕基.維生素D3,羥化16,17環(huán)氧黃體酮生成新的輕化產(chǎn)物(不同于svh001)。(5)svu005可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化雄烯二酮生成9位輕基化產(chǎn)物,以及將二苯甲酮輕化為4-羥基二苯甲酮。(6)CYP105家族的三個(gè)C家族基因的表達(dá)蛋白在多種底物代謝中表現(xiàn)出一定的共性,但D家族的svu005基因表達(dá)蛋白具有相對(duì)獨(dú)立的底物域。本研究揭示維吉尼亞鏈霉菌IBL14的CYP105基因的亞家族定位與進(jìn)化關(guān)系,探索了 CYP105家族基因的底物域,加深了羥化反應(yīng)的分子機(jī)理的理解。本研究的結(jié)果有助于改造、合成新的輕化酶,提高酶的反應(yīng)活力與環(huán)境適應(yīng)能力;在甾醇類物質(zhì)的特定位點(diǎn)、特定立體構(gòu)象引入輕基,生產(chǎn)全新的甾體藥物及藥物中間體;促進(jìn)對(duì)甾體污染物的轉(zhuǎn)化與降解。
[Abstract]:In order to clarify the function and mechanism of the CYP105 family gene in the complex secondary metabolic process , it is found that the two - dimensional structure of the CYP105 family gene is very conservative and has a similar function . The two - dimensional structure of svu001 , svu001 , svu003 , svu004 , svu003 and svu004 has a very high homology . In this paper , we identified svh001 , svu003 , svu004 as CYP105C1 , svu005 as a new subfamily of CYP105 family or a new family gene . ( 4 ) The gene cluster of CYP105 family has been successfully cloned in E . coli .

【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q93;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王崇高;陳吉祥;胡升庠;趙新潮;盧明;;RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)家族基因1克隆及序列分析[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2009年09期

2 王玉紅;徐立華;李軍;;玉米TCP家族基因生物信息學(xué)鑒定與分析[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年04期

3 白英男;馮丹丹;林軍岳;馮娟;任正隆;;GAST家族基因及蛋白研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年11期

4 陳宣茂,孫朝輝,應(yīng)康,謝毅;Rab家族基因的背景資料[J];云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1999年S3期

5 ;父母都偏心[J];大科技(百科新說);2014年03期

6 孫洪波;賈貞;韓天富;;PEBP家族基因在植物發(fā)育調(diào)控中的作用[J];植物生理學(xué)通訊;2009年08期

7 朱巖;彭振英;張斌;畢玉平;;PEBP家族基因在植物中功能的研究進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年02期

8 王其強(qiáng);談承杰;晏寒冰;朱平;;基于堿基三周期性研究P53家族基因的特征[J];生物物理學(xué)報(bào);2013年04期

9 周蓮潔;張富春;王艷;;GRAS家族基因在植物生長、代謝及逆境脅迫中的功能研究進(jìn)展[J];植物生理學(xué)報(bào);2013年09期

10 段龍飛;慕小倩;李文燕;;茉莉酸信號(hào)途徑中轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ蛋白家族的分子進(jìn)化分析[J];植物學(xué)報(bào);2013年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 郭靜;韓生成;;煙草JAZ家族基因的克隆及功能分析[A];2009中國植物學(xué)會(huì)植物細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 張文正;鄒俊杰;宋蓮芬;馬淑英;李群;武維華;;擬南芥CPK家族基因功能初步研究[A];中國遺傳學(xué)會(huì)植物遺傳與基因組學(xué)專業(yè)委員會(huì)2005年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

3 周曉今;李潔;程偉;劉海;李萌萌;張?jiān)?李文博;韓生成;王英典;;水稻ADP核糖基化因子(OsARF)家族基因的預(yù)測(cè)和表達(dá)研究[A];2009中國植物學(xué)會(huì)植物細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

4 黃貝;聶品;齊志濤;徐鎮(zhèn);;脊椎動(dòng)物干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族基因起源進(jìn)化初探[A];2008年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

5 李文林;楊國宇;李宏基;郭豫杰;魯維飛;;豬Reg家族基因的克隆與原核表達(dá)[A];全國動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

6 豐勝求;夏濤;甘莉;陳小冬;雷霆;楊在清;;豬Angptl家族基因的克隆、表達(dá)及調(diào)控研究[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

7 田望;侯聰聰;李樂攻;;OsHKT1;1和OsHKT1;5(SKC1)的電生理特性和調(diào)節(jié)[A];中國植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

8 李敏;郭遲鳴;張玉霞;趙婷婷;崔欣欣;王換樂;陳亮;;DUF1644家族基因SIDP364＆SIDP361在鹽脅迫應(yīng)答中的功能研究[A];全國園藝植物生長繁育技術(shù)及應(yīng)用研討會(huì)論文集[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 李秋蘋;OsHAP家族基因的功能研究和粒形基因GL3.2的圖位克隆[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 張銳;棉花COL家族基因的鑒定、表達(dá)與進(jìn)化分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 張雁;維吉尼亞鏈霉菌IBL14中CYP105家族基因生理功能和甾醇類定向轉(zhuǎn)化機(jī)理研究[D];安徽大學(xué);2017年

4 金丹;豬Sirtuin家族基因的克隆及脂肪生成中SIRT3的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張超;84K楊HD2亞家族基因的克隆與表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 Nguyen Thi Hung（阮氏興）;小麥IQD家族基因的克隆及功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 沈雷定;MiR156家族基因在柑橘階段發(fā)育以及成花調(diào)控中的作用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 王燕;飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及功能研究[D];山西大學(xué);2015年

5 顏麗美;GIS家族基因調(diào)控?cái)M南芥開花的分子作用機(jī)制的初步研究[D];浙江大學(xué);2014年

6 韓小東;高粱ERECTA家族基因的克隆及其干旱脅迫相對(duì)表達(dá)水平的分析[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 姚文;福州若干野生蕉ISSR分析、離體繁殖及APX克隆與表達(dá)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

8 陳蘭平;甘蔗蔗糖磷酸合成酶家族基因演化和功能研究[D];福建師范大學(xué);2015年

9 潘舒;水稻OsTHE1家族基因結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 田麗梅;番茄IMPα/β和LYK家族基因的鑒定、表達(dá)模式分析和功能研究[D];浙江大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：1743517