本文選題：激素性股骨頭壞死 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：分離、培養(yǎng)與鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,研究糖皮質(zhì)激素對(duì)MSCs成骨成脂分化的影響,尋找激素性股骨頭壞死患者M(jìn)SCs中具有顯著差異表達(dá)的miRNA。方法：依據(jù)納入條件建立樣品池,通過(guò)常規(guī)方法分離、培養(yǎng)MSCs,并用流式細(xì)胞技術(shù)做免疫表型鑒定。分別用成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)激素組與對(duì)照組MSCs,14天后分別行茜素紅S及油紅O染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞染色程度。將激素組與對(duì)照組MSCs的總RNA提取后,進(jìn)行富集與標(biāo)記,再與miRNA芯片Asymetrix 3.0雜交,攝取熒光圖像后進(jìn)行一系列軟件數(shù)據(jù)分析,最終得到差異表達(dá)的miRNA。結(jié)果：成功獲得了樣品并分組,成功分離、培養(yǎng)了MSCs,流式細(xì)胞學(xué)表型分析結(jié)果顯示出我們的細(xì)胞一致陽(yáng)性表達(dá)CD29與CD44表型,而均陰性表達(dá)人造血細(xì)胞系表型CD34與CD45。誘導(dǎo)分化與染色結(jié)果可見(jiàn)激素性股骨頭壞死患者的MSCs相比于對(duì)照組MSCs,其成骨分化能力受到抑制而成脂分化能力加強(qiáng)。芯片微陣列分析最終篩選出了2個(gè)在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)顯著升高的miRNA, miR-483-5p與miR-708,以及6個(gè)在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)顯著降低的miRNA, miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b以進(jìn)行后續(xù)研究。結(jié)論：我們所獲得的細(xì)胞是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,激素抑制了MSCs成骨分化而促進(jìn)了成脂分化。激素的使用可能導(dǎo)致了MSCs中miR-483-5p與miR-708表達(dá)增加,miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b表達(dá)降低。目的：掌握miRNA相關(guān)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),并通過(guò)此技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證微陣列分析初篩后的8個(gè)miRNA的表達(dá)變化情況,以選出其中結(jié)果穩(wěn)定且表達(dá)差異顯著的miRNA以進(jìn)行后續(xù)研究。方法：選取另外的3組激素組與對(duì)照組患者M(jìn)SCs (GCs 4-6 and Con 4-6)直接進(jìn)行PCR檢測(cè)觀察8個(gè)miRNA (miR-483-5p, miR-708, miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b)的表達(dá)水平變化。此外我們還設(shè)計(jì)了一項(xiàng)體外梯度濃度地塞米松(0 M、10-8M、10-7M和10-6M)干預(yù)MSCs的實(shí)驗(yàn),觀察直接激素干預(yù)對(duì)MSCs內(nèi)這些miRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：激素性股骨頭壞死患者的MSCs相對(duì)于對(duì)照組患者的MSCs,其miR-25, miR-92a-1, miR-708和miR-483-5p的表達(dá)具有顯著性差異(p0.05)。經(jīng)梯度濃度Dex干預(yù)后MSCs中miR-708和miR-483-5p的表達(dá)變化與此前的芯片微陣列分析結(jié)果和上述實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果一致,且具有顯著性差異,并且激素介導(dǎo)的miR-708表達(dá)變化呈現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性。此外miR-25和miR-20b的表達(dá)僅在10-6M地塞米松濃度時(shí)有顯著下降。結(jié)論：結(jié)合本冊(cè)第一部分的芯片微陣列分析,本次實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證和體外梯度濃度地塞米松干預(yù)實(shí)驗(yàn),都一致地顯示出在體內(nèi)和體外只有miR-708在糖皮質(zhì)激素的作用下表達(dá)水平顯著升高。因miR-708在以上這些結(jié)果中穩(wěn)定而顯著的差異表達(dá)情況,我們將其視為被選中的miRNA來(lái)進(jìn)行后續(xù)的作用靶點(diǎn)確認(rèn)和細(xì)胞功能分析研究。目的：掌握生物信息學(xué)、miRNA轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù),探尋miR-708的靶基因,闡述激素的使用影響MSCs成骨分化并最終導(dǎo)致激素性股骨頭壞死的機(jī)制。方法：使用諸多在線軟件工具預(yù)測(cè)miR-708可能的作用靶點(diǎn),使用MAS 3.0軟件系統(tǒng)中的Gene Ontology (GO) terms和KEGG pathway分析這些被預(yù)測(cè)的靶基因在生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)性。選定可能的靶點(diǎn)后,通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)MSCs中miR-708,并使用PCR及Western blot檢測(cè)靶基因與下游基因的表達(dá)水平變化。使用雙熒光素酶法驗(yàn)證miR-708靶向并直接抑制所預(yù)測(cè)的靶基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染下調(diào)GC-MSC中miR-708并同樣觀察相關(guān)基因蛋白的表達(dá)及隨后MSCs成骨成脂功能的變化。結(jié)果：SMAD3與SMAD4被預(yù)測(cè)為miR-708可能的作用靶點(diǎn)。評(píng)價(jià)我們的轉(zhuǎn)染效果證實(shí)良好。通過(guò)轉(zhuǎn)染.上調(diào)miR-708抑制了普通MSCs中SMAD3與RUNX2的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)SMAD3為miR-708的直接作用靶點(diǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)染下調(diào)miR-708恢復(fù)了激素組MSCs的成骨分化能力,并增加了SMAD3的表達(dá)。結(jié)論：MiR-708以SMAD3為靶基因,因激素作用而上調(diào)的miR-708直接抑制了MSCs中SMAD3的表達(dá),SMAD3基因的變化可能間接通過(guò)TGF-beta signaling等一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用影響了MSCs成骨分化重要基因RUNX2的表達(dá)水平,最終導(dǎo)致了MSCs成骨分化能力的下降,促進(jìn)了激素性股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R681.8

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本文編號(hào)：1736386