本文選題：三疣梭子蟹 + 轉(zhuǎn)錄組�。� 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)動物,在中國、朝鮮、日本等海域均有分布,我國黃渤海及東海分布尤為廣泛。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,累代養(yǎng)殖造成種質(zhì)退化,病害問題也日趨嚴(yán)重,給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。其中,白斑綜合征病毒(WSSV)以及弧菌等病原均會造成三疣梭子蟹組織病變乃至死亡。此外,作為一種重要的水體環(huán)境因子,鹽度也會對三疣梭子蟹等甲殼動物的免疫能力產(chǎn)生較大影響。三疣梭子蟹等無脊椎動物不具有獲得性免疫,但可以依賴機(jī)體自身獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng),通過一系列免疫信號通路級聯(lián)反應(yīng),抵御入侵機(jī)體的病原微生物。有鑒于此,本研究利用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)對三疣梭子蟹進(jìn)行感染并取其血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出免疫相關(guān)基因;以副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和WSSV作為病原對三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染,并通過低鹽脅迫實驗,對三疣梭子蟹先天免疫相關(guān)基因的功能進(jìn)行初步研究,為深入開展三疣梭子蟹等甲殼動物病害防御機(jī)制奠定基礎(chǔ),為有效解決養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中出現(xiàn)的病害問題提供理論支持。本論文的主要內(nèi)容如下:1.三疣梭子蟹感染溶藻弧菌轉(zhuǎn)錄組分析及免疫基因發(fā)掘溶藻弧菌作為三疣梭子蟹易感弧菌之一,會在宿主體內(nèi)增殖,造成機(jī)體細(xì)胞和組織損傷,引發(fā)“乳化病”等病害,嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而三疣梭子蟹等甲殼動物具有獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng),可以有效抵御、清除外來病原。本研究取三疣梭子蟹感染溶藻弧菌12 h血細(xì)胞和對照組血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,經(jīng)Trinity拼接共獲得75576條Unigene序列,其中63515條Unigenes得到注釋。GO功能注釋結(jié)果表明,共有14848條unigenes被分類到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別中,其中生物過程主要涉及生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、單生物進(jìn)程、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御等。共有7130條unigenes被分類到KEGG代謝通路的5個分支,主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、運(yùn)輸、分解代謝、免疫系統(tǒng)相關(guān)的信號通路。通過比較感染組和對照組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,共篩選出791個差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)的有453個,下調(diào)表達(dá)的有338個。通過對GO、KEGG富集和差異基因的分析,確定Toll樣受體基因和HMGB家族基因作為本次研究的免疫基因。此外,利用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹并進(jìn)行高通量測序,有助于進(jìn)一步探索其致病機(jī)理,并為三疣梭子蟹疾病防御及組學(xué)分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。2.三疣梭子蟹Toll家族基因的克隆與表達(dá)分析三疣梭子蟹等無脊椎動物先天免疫主要是由胚系基因所編碼的模式識別受體所介導(dǎo),Toll樣受體便是一種重要的模式識別受體。本研究采用RACE技術(shù)克隆得到了三疣梭子蟹Toll樣受體家族中的2個新基因,分別命名為Pt Toll4和Pt Toll5。其中,Pt Toll4基因c DNA全長4276 bp,包含2685 bp的開放閱讀框(ORF),編碼一個含有895個氨基酸,分子量102.5 k D,理論等電點6.03的蛋白質(zhì);Pt Toll5基因c DNA全長4914 bp,包含4083 bp的開放閱讀框(ORF),編碼一個含有1361個氨基酸,分子量151.6 k D,理論等電點5.69的蛋白質(zhì)。Pt Toll4、Pt Toll5蛋白均具有典型的Toll家族結(jié)構(gòu)域,是I型跨膜蛋白,存在胞外LRR結(jié)構(gòu)域(其中Pt Toll4包含LRRCT結(jié)構(gòu),Pt Toll5包含LRRNT結(jié)構(gòu))及保守的胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域。同源分析表明Pt Toll4氨基酸序列與中華絨螯蟹Es Toll2的同源性最高,為61%;Pt Toll5氨基酸序列與羅氏沼蝦Mr Toll的同源性最高,為75%。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,Pt Toll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高,在肝胰腺中的表達(dá)量最低,而Pt Toll5在眼柄中的表達(dá)量最高,在血細(xì)胞中的表達(dá)量最低。利用副溶血弧菌和WSSV對三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染,結(jié)果表明,經(jīng)WSSV感染后Pt Toll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量顯著提高,在6 h時出現(xiàn)峰值,為對照組的5.03倍(P0.01)。經(jīng)副溶血弧菌感染后Pt Toll4基因僅在48 h略微出現(xiàn)上調(diào),其余時間點與對照組無顯著差異。經(jīng)WSSV感染后,Pt Toll5基因在血細(xì)胞中出現(xiàn)了整體的表達(dá)下調(diào),48 h達(dá)到了表達(dá)量的最低值,為對照組的0.27倍(P0.05)。經(jīng)WSSV感染后,Pt Toll5基因在血細(xì)胞中同樣出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象,48 h出現(xiàn)了表達(dá)量的最低值,為對照組的0.53倍(P0.05)。由此我們推測Pt Toll4基因在三疣梭子蟹應(yīng)答WSSV的免疫過程中發(fā)揮了重要功能,而Pt Toll5的下調(diào)表達(dá)可能也會造成三疣梭子蟹免疫力下降。此外發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫顯著抑制了Pt Toll4、Pt Toll5基因在三疣梭子蟹血細(xì)胞中的表達(dá),這可能是導(dǎo)致低鹽環(huán)境下三疣梭子蟹等甲殼類動物免疫能力下降的原因之一。對Pt Toll5中發(fā)現(xiàn)的SNP位點進(jìn)行抗病能力關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明未能有效關(guān)聯(lián)。綜上分析,Pt Toll4、Pt Toll5基因在三疣梭子蟹先天免疫過程中發(fā)揮了重要功能,并為深入開展三疣梭子蟹和其他甲殼動物的免疫調(diào)控機(jī)理研究提供了數(shù)據(jù)支持。3.三疣梭子蟹HMGB家族基因的克隆與表達(dá)分析高遷移率族蛋白B(high-mobility group box protein,HMGB)是一種典型的HMG家族蛋白,在調(diào)節(jié)DNA重組、修復(fù)、復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄方面均起著重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn),脊椎動物中的HMGB1可由凋亡細(xì)胞或經(jīng)IL-1β等炎癥因子激活的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外并與先天免疫信號通路TLR家族中的TLR2、TLR4、TLR9等受體結(jié)合,調(diào)節(jié)多種免疫炎癥反應(yīng)。為研究三疣梭子HMGB家族基因在先天免疫中發(fā)揮的功能,本實驗利用RACE技術(shù)首次克隆得到了2個三疣梭子蟹HMGB基因,分別命名為Pt HMGBa、Pt HMGBb。其中,Pt HMGBa基因c DNA序列全長1030bp,開放閱讀框(ORF)為681bp,編碼了一個含有227個氨基酸,分子量25.82 k D,理論等電點為5.94的蛋白質(zhì)。Pt HMGBb基因c DNA序列全長981bp,開放閱讀框(ORF)為618 bp,編碼了一個含有206個氨基酸,分子量24.07 k D,理論等電點為6.28的蛋白質(zhì)。Pt HMGBa和Pt HMGBb蛋白均包含兩個HMG盒結(jié)構(gòu)域和一個酸性尾部結(jié)構(gòu)域,符合HMGB家族蛋白的典型特征。同源分析分析表明,Pt HMGBa和Pt HMGBb氨基酸序列分別與凡納濱對蝦Lv HMGBa和Lv HMGBb相似度最高。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,Pt HMGBa、Pt HMGBb基因均在血細(xì)胞的表達(dá)量最高。利用副溶血弧菌和WSSV對三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染,結(jié)果表明,Pt HMGBa基因經(jīng)副溶血弧菌感染6 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)且出現(xiàn)表達(dá)量的峰值,為對照組的3.5倍(P0.05),經(jīng)WSSV后,Pt HMGBa于12 h出現(xiàn)顯著上調(diào)且達(dá)到對照組的2.3倍(P0.05);經(jīng)副溶血弧菌感染后,Pt HMGBb基因在三疣梭子蟹血細(xì)胞中,于24 h達(dá)到表達(dá)量的峰值,為對照組的2.5倍(P0.05),經(jīng)WSSV感染后,Pt HMGBb在12 h達(dá)到峰值,表達(dá)量達(dá)到了對照組的5.2倍(P0.05)。由此可知Pt HMGBa、Pt HMGBb在不同病原入侵后都會被誘導(dǎo)表達(dá)。而經(jīng)低鹽脅迫后,表達(dá)量會被嚴(yán)重抑制,從而可能影響機(jī)體的先天免疫能力,根據(jù)以上結(jié)果推測Pt HMGBa、Pt HMGBb基因均參與了三疣梭子蟹抵御外來病原的免疫響應(yīng),為深入開展三疣梭子蟹和其他甲殼動物的免疫調(diào)控機(jī)理研究提供了有力證據(jù)。
[Abstract]:Portunus trituberculatus ( Portunus trituberculatus ) is an important marine economic animal , which is widely distributed in China , North Korea , Japan and other sea areas . The expression of Toll - like receptor gene and HMGB family gene were identified by RACE technique . The results showed that the expression of Pt Toll4 gene in blood cells increased significantly after infection . The results showed that the expression of Pt Toll4 gene was down - regulated in blood cells . The results showed that Pt HMGBa and Pt HMGBb had the highest expression level after 6 h . The results showed that Pt HMGBa and Pt HMGBb had the highest expression level after 6 h .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S945

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1734991