本文選題：赤擬谷盜　切入點(diǎn)：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HATs)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylases, HDACs)共同調(diào)節(jié)的組蛋白乙�；潜碛^遺傳調(diào)控的一種重要機(jī)制。作為RNA聚合酶II(RNAP-II)延伸復(fù)合體的催化亞基,Elp3屬于GNAT家族組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,能夠在體內(nèi)和體外乙�；M蛋白H3和H4。赤擬谷盜Tribolium castaneum(鞘翅目擬步甲科)是一種危害嚴(yán)重的世界性農(nóng)業(yè)糧食害蟲,也是所有昆蟲中系統(tǒng)性RNA干擾最有效的昆蟲。本文克隆了赤擬谷盜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Elp3基因,分析了Elp3基因在赤擬谷盜不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平,在此基礎(chǔ)上利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)研究了其功能,研究結(jié)果對于進(jìn)一步深入了解組蛋白乙�；诶ハx生長發(fā)育中的功能和昆蟲對逆境脅迫的適應(yīng)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。通過反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)克隆了赤擬谷盜Elp3基因全長cDNA序列,命名為cElp3。TcElp3開放閱讀框長1776 bp,編碼591個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為67.74kDa,等電點(diǎn)為8.66。高度保守的GNAT-type HAT結(jié)構(gòu)域(Pfam accession no. PF00583)位于羧基端493-539位氨基酸；另一個(gè)保守的Radical SAM(S-adenosylmethionine)結(jié)構(gòu)域(Pfam accession no.PF04055)位于氨基端98-346位氨基酸。多重序列比對表明,TcElp3與同為鞘翅目的中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae同源基因的氨基酸序列一致性最高,為81.36%,與意大利蜜蜂Apis mellifera同源基因的氨基酸序列一致性為76.48%,與小菜蛾P(guān)lutella xylostella、黑腹果蠅Drosophila melanogaster、豌豆蚜蟲Acyrthosiphon pisum和褐飛虱Nilaparvata lugens同源基因的氨基酸序列一致性分別為75.59%、75.30%、74.62%和74.54%。系統(tǒng)發(fā)生分析也表明,TcElp3基因與中歐山松大小蠹同源基因的親緣關(guān)系最近。通過熒光定量PCR研究了TcElp3基因在赤擬谷盜1日齡和3日齡卵、1天、5天和20天幼蟲、1天和5天蛹、1天和7天雌蟲、1天和7天雄蟲等不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明,TcElp3基因在各個(gè)發(fā)育階段都能表達(dá),其中3日齡卵的表達(dá)水平最低,在5天幼蟲中的表達(dá)水平最高,蛹期和成蟲期的表達(dá)水平無顯著差異。RNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)TcElp3基因在晚期幼蟲被抑制表達(dá)時(shí),所有干擾組的赤擬谷盜幼蟲都能成功進(jìn)入化蛹階段,但是大部分蟲體在蛹期發(fā)育遲緩,并出現(xiàn)翅的畸形,98.33%的蟲體在蛹期死亡。少數(shù)羽化的成蟲出現(xiàn)后翅折疊的異常,并在次日全部死亡。RNAi后第6天,分別對干擾組、IB組和CK組幼蟲進(jìn)行過氧化氫處理,48小時(shí)后干擾組死亡率高達(dá)84.72%,而CK組和IB組死亡率分別為25%和26.39%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),干擾組的兩種過氧化氫酶基因(TcCatl和TcCat2)的表達(dá)水平相對于對照都有顯著降低,其中TcCatl基因降低了49.65%,而TcCat2基因降低了85.17%。這些研究結(jié)果表明TcElp3基因在赤擬谷盜的生長發(fā)育過程中以及對氧化脅迫的適應(yīng)性方面起到重要作用。
[Abstract]:The catalytic subunit Elp3, which acts as an extension complex of RNA polymerase II RNAP-II, belongs to the GNAT family of histone acetyltransferases, and can acetylated histone H3 and H4 in vivo and in vitro.Tribolium castaneum (Coleoptera Caraneum) is one of the most harmful agricultural food pests in the world. It is also the most effective insect with systematic RNA interference in all insects.In this paper, the Elp3 gene of histone acetyltransferase (Elp3) was cloned, and the expression level of Elp3 gene was analyzed at different developmental stages, and its function was studied by RNA interference RNA interference RNAi technique.The results have important scientific significance for further understanding the function of histone acetylation in insect growth and development and the adaptation mechanism of insect to stress.The full-length cDNA sequence of Elp3 gene was cloned by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). It was named cElp3.TcElp3 open reading frame 1776 BP, encoding 591 amino acid residues. The predicted molecular weight was 67.74 kDa and the isoelectric point was 8.66.The highly conserved GNAT-type HAT domain Pfam accession no.PF00583) is located at the carboxyl terminal 493-539 amino acids, and another conserved Radical SAM S-adenosylmethionine domain Pfam accession no. PF04055) is located at the amino terminal 98-346 amino acids.Multiple sequence alignment showed that TcElp3 had the highest amino acid sequence identity with Dendroctonus ponderosae homologous gene of Coleoptera.The amino acid sequence of the homologous gene was 76.48, 75.59% and 74.54% with Plutella xylostella xylostella, Drosophila melanogaster, Acyrthosiphon pisum and Nilaparvata lugens, respectively.Phylogenetic analysis also showed that TcElp3 gene was most closely related to the homologous gene of Prunus sibiricus.The mRNA expression dynamics of TcElp3 gene were studied by fluorescence quantitative PCR at different developmental stages of 1 day and 3 day old eggs at 1 and 20 days of age, 1 day and 5 days, 1 day and 7 days of female larvae, respectively.The results showed that TcElp3 gene could be expressed in all stages of development, and the expression level of TcElp3 gene was the lowest in 3-day-old eggs and the highest in 5-day larva, but there was no significant difference between pupae stage and adult stage. RNA interference test showed that the expression level of TcElp3 gene was the lowest in 3-day-old eggs.When the expression of TcElp3 gene was inhibited in the late stage of larva, all the interfering larvae could successfully enter the stage of pupation, but most of them were stunted in pupal stage, and 98.33% of them died in pupal stage.A few adult Eclosion worms showed abnormal folding of their hind wings and died 6 days after all the death of RNAi the next day.After treated with hydrogen peroxide for 48 hours, the mortality rate of interference group was 84.72, while that of CK group and IB group was 25% and 26.39%, respectively.Further studies showed that the expression levels of TcCatl and TcCat2) of the two catalase genes in the interference group were significantly lower than those in the control group. The TcCatl gene decreased by 49.65 and the TcCat2 gene decreased by 85.17.These results suggest that the TcElp3 gene plays an important role in the growth and development process and the adaptability to oxidative stress.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S379.5

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