本文選題：桑樹　切入點(diǎn)：茉莉酸　出處：《西南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：植物激素是由植物體產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物,具有低濃度高效應(yīng)的特點(diǎn)。植物激素具有廣譜的生理作用,在植物生長發(fā)育的各個(gè)過程(細(xì)胞分裂、向性生長、器官形成、開花、種子發(fā)育、衰老)和環(huán)境應(yīng)答(如高溫、鹽堿、病蟲害)中都發(fā)揮重要功能。茉莉酸是一種環(huán)戊酮類植物激素,最早從真菌的濾液中分離出來。茉莉酸廣泛分布于植物的各個(gè)組織。已有大量研究表明茉莉酸在植物防御植食性昆蟲方面作用突出。目前,茉莉酸的生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已在模式植物中被闡明。桑樹是一種多年生木本植物,除傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶外,桑樹在生態(tài)、保健、醫(yī)藥方面的作用也十分突出。但在自然條件下,桑樹的蟲害非常嚴(yán)重,傳統(tǒng)的噴灑農(nóng)藥不僅容易使害蟲產(chǎn)生耐藥性,還會(huì)對(duì)人類健康造成影響。因此,提高桑樹抗蟲害能力對(duì)桑樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)的方法從川桑(Morus notabilis)全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了參與桑樹茉莉酸生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。隨后,采用家蠶咬食和機(jī)械損傷處理的川桑組培苗作為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析兩種處理方式下川桑體內(nèi)基因的表達(dá)情況以及激素相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化,繼而通過酵母雙雜交篩選茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白Mn NINJAl和Mn NINJAs的互作蛋白,最后通過轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Mn NINJAl和Mn NINJAs進(jìn)行功能研究。本研究所獲研究結(jié)果如下:1、川桑茉莉酸生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因的鑒定和信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)的方法,我們?cè)诖ㄉ；蚪M中共鑒定到74個(gè)參與茉莉酸生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因,其中39個(gè)基因參與茉莉酸的生物合成,另外35個(gè)基因參與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)構(gòu)域分析顯示這些基因在川桑中非常保守,聚類分析結(jié)果表明這些基因在川桑中的表達(dá)具有組織偏好性。OPR是茉莉酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶。川桑中有7個(gè)OPR基因,它們串聯(lián)排布在3個(gè)scaffold上。系統(tǒng)發(fā)生分析表明在川桑中可能有兩個(gè)OPR基因催化茉莉酸的生物合成,同時(shí),還鑒定到一類之前未鑒定到的Group III分支的OPR蛋白,它們?nèi)縼碜詥巫尤~植物。順式作用元件分析表明Mn OPR基因可以響應(yīng)多種激素處理和環(huán)境脅迫。JAZ是茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子。在川桑中鑒定到6個(gè)Mn JAZ基因。同其它已報(bào)道植物物種相比,川桑JAZ基因數(shù)目最少,冗余度較低。對(duì)這6個(gè)Mn JAZ基因進(jìn)行克隆,發(fā)現(xiàn)同擬南芥相比,川桑Mn JAZ基因結(jié)構(gòu)非常保守。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)川桑中同樣存在截短形式的Mn JAZ5。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示除Mn JAZ4以外,其它JAZ蛋白都含有保守的TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別被一個(gè)保守的內(nèi)含子隔開。定量PCR分析顯示在川桑中6個(gè)Mn JAZ基因具有不同的組織表達(dá)模式。在川�；蚪M中,我們鑒定到擬南芥At NINJA的同源基因,但是該基因長度明顯變短,其編碼的蛋白質(zhì)缺失了N端保守的EAR基序�；诖�,我們通過設(shè)計(jì)簡并引物的方法對(duì)川桑NINJA基因進(jìn)行克隆,最終克隆到全長Mn NINJA,多序列比對(duì)表明該基因在植物中非常保守。同時(shí),我們?cè)诖ㄉ DNA上也克隆到預(yù)測(cè)的Mn NINJA基因,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)川桑中Mn NINJA存在選擇性剪切,我們將其產(chǎn)生的兩種轉(zhuǎn)錄本形式分別命名為Mn NINJAl和Mn NINJAs。2、咬食和機(jī)械損傷處理下川桑的轉(zhuǎn)錄組分析我們采用家蠶咬食和機(jī)械損傷這兩種處理方式,收集處理后1 h、8 h、16 h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(分別代表早期、中期、晚期)的川桑組培苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以處理前后表達(dá)量變化大于1.5倍作為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的差異基因進(jìn)行分析,在8 h時(shí)間點(diǎn),川桑體內(nèi)差異基因的數(shù)目最多。熱度圖分析表明在處理后1 h和8 h時(shí)間點(diǎn),咬食和機(jī)械損傷處理下川桑體內(nèi)差異基因的表達(dá)模式相近,而在16 h時(shí)間點(diǎn),表達(dá)模式差異較大。KEGG富集分析顯示在1 h時(shí)間點(diǎn),α-亞麻酸途徑顯著富集,而在8 h和16 h時(shí)間點(diǎn),光合作用相關(guān)通路顯著富集。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中參與茉莉酸生物合成途徑的基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Mn AOS1、Mn AOC1、Mn OPR6、Mn LOX2C、Mn OPCL1被強(qiáng)烈誘導(dǎo),說明在處理的早期階段川桑體內(nèi)大量合成茉莉酸。茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,Mn MYC2僅在1 h時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào),Mn JAZ1、Mn JAZ3、Mn JAZ4在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均強(qiáng)烈表達(dá)。咬食處理下Mn JAZs的表達(dá)水平檢測(cè)表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果可靠。我們對(duì)咬食和損傷處理下參與其它激素途徑的差異基因進(jìn)行聚類分析,大量參與赤霉素、乙烯、水楊酸、脫落酸等激素生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo),其中,大部分參與赤霉素、生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因在處理后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中我們沒有鑒定到Mn NINJAl。通過家蠶咬食川桑幼苗葉片,選取0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)Mn NINJAl的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。定量PCR結(jié)果顯示Mn NINJAl的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì),并且在損傷部位與未損傷部位的表達(dá)模式相似。激素處理實(shí)驗(yàn)表明Mn NINJAl除響應(yīng)茉莉酸甲酯以外,還可以響應(yīng)水楊酸、赤霉素和乙烯的誘導(dǎo)。Western Blot分析表明Mn NINJAl在川桑的八個(gè)組織中均有表達(dá),在幼葉中表達(dá)量最高,并且轉(zhuǎn)錄本水平與蛋白水平趨勢(shì)不一致,而Mn NINJAs在川桑各個(gè)組織中均未檢測(cè)到表達(dá)。3、Mn NINJAl和Mn NINJAs的功能研究通過酵母雙雜交的方法,我們篩選了Mn NINJAl和Mn NINJAs的互作蛋白。采用酵母細(xì)胞融合進(jìn)行篩選,我們最終篩選到與Mn NINJAl和Mn NINJAs互作的陽性克隆分別為6個(gè)(含8個(gè)基因)和3個(gè)(2個(gè)基因)。回復(fù)驗(yàn)證后,與Mn NINJAl互作的克隆中只有編號(hào)為14、52、99和100為陽性,其它均為自激活或假陽性,與Mn NINJAs互作的2個(gè)基因全部為陽性。由于在篩選過程中Mn JAZ4、Mn JAZ5與Mn NINJAl互作,Mn JAZ1、Mn JAZ3與Mn NINJAs互作,因此我們對(duì)6個(gè)Mn JAZ全部構(gòu)建獵物載體,酵母雙雜交結(jié)果顯示6個(gè)Mn JAZ蛋白都能和Mn NINJAl發(fā)生互作,而Mn NINJAs與Mn JAZ4相互作用較弱,與剩余5個(gè)Mn JAZ蛋白均能互作。我們對(duì)編號(hào)為99和100的兩個(gè)基因進(jìn)行分析,他們分別編碼類泛素結(jié)合酶(SUMO-conjugating enzyme,SCE1)SCE和4-香豆酸-輔酶A連接酶(4-coumarate-Co A ligase-like 5,OPCL1),我們將其命名為Mn SCE1和Mn OPCL1。OPCL參與茉莉酸的生物合成,在咬食和機(jī)械損傷處理下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。SCE1參與蛋白的類泛素化過程,在脫落酸響應(yīng)、擬南芥幼苗發(fā)育、溫度響應(yīng)以及病毒侵染植物的過程中都發(fā)揮重要作用。我們利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在模式植物擬南芥中異源表達(dá)川桑Mn NINJAl和Mn NINJAs。定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)表明Mn NINJAl和Mn NINJAs在擬南芥中過量表達(dá)。同野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥在表型上沒有表現(xiàn)出明顯的差異。我們隨后選取茉莉酸響應(yīng)基因At PDF1.2、At VSP2進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。At VSP2在過表達(dá)Mn NINJAs的擬南芥株系中表達(dá)量顯著下調(diào),而At PDF1.2的表達(dá)不受影響。Mn NINJAl可以上調(diào)At PDF1.2的表達(dá)。對(duì)于At VSP2,Mn NINJAl在一定濃度范圍內(nèi)可以上調(diào)其表達(dá),超過閾值后則會(huì)抑制其表達(dá)。同時(shí),Mn NINJAl和Mn NINJAs在擬南芥中過量表達(dá)也會(huì)影響其它激素響應(yīng)基因的表達(dá)水平。水楊酸響應(yīng)基因At PR-1和和脫落酸響應(yīng)基因At ERD10的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào),生長素響應(yīng)基因At IAA11和At ARF8的表達(dá)全部出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。擬南芥中過量表達(dá)Mn NINJAl和Mn NINJAs也顯著影響了赤霉素響應(yīng)基因At GASA1和At GASA6的表達(dá)水平。本研究通過生物信息學(xué)的方法在川桑基因組中鑒定到74個(gè)參與茉莉酸生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因。結(jié)構(gòu)域分析、系統(tǒng)發(fā)生分析、多序列比對(duì)分析、基因結(jié)構(gòu)分析表明川桑中這些基因與已報(bào)道植物物種相比具有較高的保守性,暗示在川桑中它們可能發(fā)揮類似的功能。咬食和機(jī)械損傷處理下的轉(zhuǎn)錄組分析表明這兩種處理方式下差異基因在前期、中期表達(dá)模式相近,在后期表現(xiàn)出更大的差異。在1 h時(shí)間點(diǎn),茉莉酸生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因被顯著誘導(dǎo),茉莉酸途徑開啟。其它激素途徑基因的表達(dá)也在這兩種處理方式下不同程度地被誘導(dǎo)。咬食、激素處理下的表達(dá)模式和酵母雙雜交結(jié)果表明Mn NINJAl除了參與茉莉酸信號(hào)途徑外,還可以參與其它激素響應(yīng)和生理過程。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明異源表達(dá)川桑Mn NINJAl和Mn NINJAs對(duì)擬南芥中茉莉酸、水楊酸、脫落酸、生長素、赤霉素下游響應(yīng)基因的表達(dá)水平都產(chǎn)生了顯著影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S888.2

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本文編號(hào)：1724006