本文選題：h　切入點：OGG1基因　出處：《南昌大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分h OGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與糖尿病患者冠脈病變的對照研究目的了解糖尿病患者h(yuǎn) OGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與冠脈病變之間的關(guān)系。方法入選行冠狀動脈造影術(shù)的糖尿病患者共323例,應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測每位患者的h OGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性。同時檢測患者血糖、血脂、腎功能等生化指標(biāo)。根據(jù)患者h(yuǎn) OGG1基因Ser326Cys多態(tài)性分為3組:Cys/Cys基因型組(85例)、Ser/Ser基因型組(117例)和Ser/Cys基因型組(121例)。由兩名心血管醫(yī)師對冠脈造影圖像進(jìn)行分析,按評判標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計冠脈病變支數(shù)、病變復(fù)雜程度及Gensini評分和SYNTAX評分。分析h OGG1基因Ser326Cys多態(tài)性對h OGG1 m RNA表達(dá)和血8-OHd G水平的影響,以及這種影響對冠脈病變產(chǎn)生的結(jié)果。結(jié)果1.Cys/Cys基因型8-Ohd G水平高于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,而h OGG1m RNA水平低于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而Ser/Ser基因型與Ser/Cys基因型兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.Cys/Cys基因型出現(xiàn)三支病變的概率最高,Ser/Ser基因型出現(xiàn)單支病變的概率最高,但三組之間在冠脈受累支數(shù)方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.Cys/Cys基因型的Gensini評分和SYNTAX評分和冠脈復(fù)雜病變概率均高于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型之間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論h OGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與糖尿病患者冠脈病變有明顯的關(guān)系,其中Cys/Cys基因型的冠脈病變可能更為嚴(yán)重。其機制可能為Cys/Cys基因型的h OGG1表達(dá)水平下降,識別和切除DNA雙鏈中的8-OHd G能力降低,修復(fù)DNA氧化損傷的能力下降,從而加速動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。第二部分高血糖誘導(dǎo)VECs氧化應(yīng)激及線粒DNA損傷的研究目的研究高血糖對HUVECs的氧化應(yīng)激及細(xì)胞mt DNA損傷方法將HUVECs置于含有30mmol/L D-葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),分別在高糖培養(yǎng)前及培養(yǎng)后的12h,24h,48h用倒置熒光顯微鏡觀察HUVECs形態(tài)。同時,在上述各時間點檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、8-OHd G及h OGG1 m RNA的表達(dá)水平,并檢測HUVECs的DNA及mt DNA的損傷情況。結(jié)果1.在高血糖狀態(tài)下,HUVECs隨著暴露時間的延長,細(xì)胞變得明顯稀疏,體積增大,細(xì)胞輪廓逐漸變得不清晰。細(xì)胞的胞質(zhì)界限不清且胞核大小不等,染色變淡。2.在高血糖狀態(tài)下,HUVECs內(nèi)8-OHd G、ROS水平隨時間的延長逐漸增高,顯示HUVECs的DNA、mt DNA損傷情況也逐漸加重。同時細(xì)胞內(nèi)的h OGG1表達(dá)水平增加。3.在高血糖狀態(tài)下,雖然HUVECs氧化修復(fù)過程強化,但與氧化損傷水平相比,h OGG1/ROS比值仍表現(xiàn)下降的特點。結(jié)論高血糖狀態(tài)下,HUVECs內(nèi)8-OHd G、ROS水平隨暴露時間的延長逐漸增高,同時細(xì)胞內(nèi)的氧化修復(fù)過程的增強,表現(xiàn)在h OGG1表達(dá)水平增加。但在高血糖狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)自身修復(fù)能力仍低于細(xì)胞氧化損傷程度,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、功能的改變。第三部分線粒體內(nèi)h OGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的VECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的研究實驗一腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的線粒體內(nèi)h OGG1基因過表達(dá)HUVECs的構(gòu)建與鑒定目的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建線粒體內(nèi)h OGG1基因過表達(dá)的HUVECs以供進(jìn)一步的研究。方法分以下四步進(jìn)行:1.含有線粒體靶向序列的MTS-h OGG1基因PCR擴增。2.質(zhì)粒載體p ENTRTM3C和目的基因MTS-h OGG1的連接。質(zhì)粒載體p ENTRTM3C和目的基因MTS-h OGG1建立酶切體系,連接建立重組質(zhì)粒。p ENTRTM3C-MTS-h OGG1行基因測序、雙酶切及PCR鑒定成功與否。3.重組質(zhì)粒與腺病毒載體進(jìn)行同源重組。取重組質(zhì)粒p ENTRTM3C-MTSh OGG1和腺病毒載體p Ad/CMV/V5-DEST進(jìn)行重組,篩選所得到的陽性克隆子,進(jìn)行PCR鑒定。4.分別在HUVECS培養(yǎng)皿中分別加入重組腺病毒p Ad/CMV/V5-DESTMTS-h OGG1和空白腺病毒p Ad/CMV/V5-GW/lac Z,并與單純的HUVECs作為對照。培養(yǎng)48h后,采用Westem blot法檢測三組HUVECs的MTS-h OGG1表達(dá)情況。結(jié)果1.以pc DNA3.1(+)-MTS-h OGG1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,得到與插入目的片段大小一致的1200bp的電泳條帶,證明質(zhì)粒重組成功。2.重組質(zhì)粒p ENTRTM3C-MTS-h OGG1的構(gòu)建。經(jīng)測序檢測和插入目的片段一致,并經(jīng)Bam H I和Xho I雙酶切后,瓊脂糖電泳出現(xiàn)一條2200bp和一條1200bp的兩條條帶,其中2200bp條帶為原質(zhì)粒p ENTRTM3C的線性片段,1200bp的為插入片段。證實成功構(gòu)建重組質(zhì)p ENTRTM3C-MTs-h OGG1。3.重組腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1轉(zhuǎn)染的HUVECs、腺病毒載體Pad/CMV/V5-GW/lac Z轉(zhuǎn)染的HUVECs細(xì)胞及HUVECs的h OGG1/β-actin分別為1.02±0.12,0.51±0.08,0.53±0.07。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析證實重組腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1轉(zhuǎn)染的HUVECs線粒體內(nèi)h OGG1基因過表達(dá)構(gòu)建成功。結(jié)論應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)利用腺病毒載體p Ad/CMV/V5-DEST可以成功構(gòu)建線粒體h OGG1基因過表達(dá)HUVECs。實驗二線粒體h OGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的VECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的研究目的研究線粒體h OGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的影響。方法分別取重組腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1轉(zhuǎn)染的HUVECs(目的基因組)、腺病毒載體Pad/CMV/V5-GW/lac Z轉(zhuǎn)染的HUVECs細(xì)胞(空白基因組)及HUVECs(空白對照組)同時置于含30mmol/L的D-葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并分別于高糖培養(yǎng)前及后12h、24h、48h分別檢測HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS、8-OHd G及線粒體膜電位變化,同時檢測HUVECs的DNA的損傷情況。結(jié)果1.隨著HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)時間延長,三組HUVECs產(chǎn)生ROS、8-OHd G的含量逐漸增強(p0.05)。在相同時間點,目的基因組的HUVECs之間產(chǎn)生的ROS、8-OHd G含量低于空白基因組和空白對照組(p0.05),而空白基因組與空白對照組間未見統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。2.各組HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)前及培養(yǎng)后12h,24h,48h后分別行JC-1熒光染色后流式細(xì)胞儀檢測,其中目的基因組紅色熒光與綠色熒光平均熒光強度比值最高(p0.05);而空白基因組和空白對照組紅色熒光與綠色熒光平均熒光強度比值明顯下降(p0.05)。而空白基因轉(zhuǎn)染組和空白對照組之間未見明顯差異(p0.05)。結(jié)論線粒體h OGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷具有修復(fù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R543.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 張衛(wèi)茹,侯凡凡,劉尚喜,郭志堅,周展眉,王國保,富寧,劉志強,王力,周玫;晚期糖基化終產(chǎn)物通過氧化應(yīng)激加速動脈粥樣硬化斑塊形成[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年13期

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本文編號：1723906