本文選題：CYP11B1基因　切入點(diǎn)：11β-OHD　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:先天性腎上腺增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一組由于控制腎上腺皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮合成的各種酶缺乏導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病。CAH患者根據(jù)不同的酶缺陷而有非常廣泛的臨床表現(xiàn)譜,這些酶包括21-羥化酶,11β-羥化酶,3β-羥類固醇脫氫酶,17α-羥化酶等[1]。11β-羥化酶缺陷癥(11β-hydroxylasedeficiency,11β-OHD)是CAH的第二大原因,占CAH5-8%,在非近親結(jié)婚人群中發(fā)病率約為1:100 000-1:200 000[2]。1 1β-OHD根據(jù)臨床癥狀嚴(yán)重程度及酶活性的缺陷程度分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。典型的11β-OHD引起特征性的皮質(zhì)醇合成減少。皮質(zhì)醇缺乏反饋性增加促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)增加,引起腎上腺皮質(zhì)增生,伴隨類固醇前體物質(zhì)增加,從而促進(jìn)雄激素合成通路亢進(jìn)。過多的腎上腺來源雄激素導(dǎo)致女性男性化、假兩性畸形、男性假性性早熟。皮質(zhì)酮通路受阻導(dǎo)致11-去氧皮質(zhì)酮(1 1-Deoxycorticosterone,DOC)及其代謝物積聚,這些物質(zhì)具有鹽皮質(zhì)激素活性,從而導(dǎo)致鈉潴留及容量擴(kuò)張[3]。編碼11β-羥化酶的基因CYP11B1位于8q24.3,包含9個外顯子。該基因長5.4kb,功能上與合成醛固酮(ALD)的CYP11B2基因相似。這兩個基因具有95%的序列同源性,相距約40kb。與21-羥化酶患者中基因型與表型具有良好的相關(guān)性不同,在11β-OHD患者中很難預(yù)測突變對酶活性及臨床表型的影響,這與11β-OHD患者數(shù)量較少,難以形成大規(guī)模研究有關(guān)[4]。但是,CYP11B1基因分析可以協(xié)助確診11β-OHD以及有助于遺傳咨詢。研究目的:本研究采集了一例高血壓伴低血鉀患者,明確患者為經(jīng)典型11β-OHD。對患者及其家系進(jìn)行CYP11B1基因分析,發(fā)現(xiàn)了一種剪接突變。利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)明確患者遺傳形式;利用小基因技術(shù),通過質(zhì)粒構(gòu)建體外表達(dá)mRNA,明確該剪接突變對mRNA的影響。研究方法:通過實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)合患者家系資料收集,達(dá)到臨床診斷11β-OHD目的。用EDTA抗凝管留取患者及家系外周血,利用試劑盒提取外周血單個核細(xì)胞DNA。根據(jù)基因文庫中CYP11B1基因序列,利用軟件primerpremier 6.0設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增各個外顯子區(qū)域及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)域。分別使用患者及父母DNA為模板擴(kuò)增,目的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離并純化后,利用ABI 3130xl基因測序儀測序,并利用Autoassembler2.0軟件將測序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫下載的基因組序列進(jìn)行比對,從而找出突變位點(diǎn)�；驕y序結(jié)果顯示患者為純合點(diǎn)突變,母親為雜合點(diǎn)突變,父親未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),因此推測患者CYP11B1基因存在父源的大段缺失突變。為此,我們設(shè)計(jì)引物通過圍繞基因點(diǎn)突變兩側(cè)擴(kuò)增,產(chǎn)物為150bp,通過熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)對該片段拷貝數(shù)定量。此外,由于該突變?yōu)榧艚油蛔?為明確突變對mRNA剪接的影響,我們利用小基因技術(shù),通過質(zhì)粒構(gòu)建并導(dǎo)入工程細(xì)胞中來體外表達(dá),明確突變對mRNA剪接的影響。研究結(jié)果:1.臨床診斷:患者臨床確診為經(jīng)典型11β-OHD�；颊呒蚁党蓡T中父親、母親、哥哥、姐姐均表型正常。2.患者及家系突變檢測結(jié)果:(1)Sanger測序顯示患者CYP11B1基因c.595+1GA純合形式突變。該突變?yōu)榧艚油蛔?經(jīng)初步生物信息學(xué)分析(Augustus)明顯影響mRNA剪接�；颊吣赣H、姐姐攜帶c.595+1GA雜合突變,父親該位點(diǎn)未見異常。3.熒光實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果:發(fā)現(xiàn)目的片段存在雜合缺失,該片段跨越第3外顯子3'端和第3內(nèi)含子5'端,包含突變位點(diǎn)。4.突變對mRNA剪接的影響:瓊脂糖凝膠電泳顯示患者組mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA較對照組長100bp左右。經(jīng)過基因測序發(fā)現(xiàn),突變型mRNA較野生型多出了第3內(nèi)含子序列,提示該剪接突變導(dǎo)致第3內(nèi)含子滯留,從而影響蛋白編碼及酶結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:The study background : congenital adrenal hyperplasia ( CAH ) is a group of autosomal recessive inherited diseases caused by various enzymes that control the synthesis of adrenocorticotropic hormone ( CAH ) . These enzymes include 21 - hydroxylase , 11尾 - hydroxylase , 3beta - hydroxysteroid dehydrogenase , 17偽 - hydroxylase , etc . The gene CYP11B1 , which encodes 11 尾 - hydroxylase , is located at 8q24 . 3 . It contains 9 exons . The gene has a length of 5.4 kb and is functionally similar to the CYP11B2 gene of synthetic aldosterone ( ALD ) . The gene has a sequence homology of 95 % . It has a good correlation with genotype and phenotype in 21 - hydroxylase patients . It is difficult to predict the effect of mutation on enzyme activity and clinical phenotype in 11尾 - OHD patients . This is related to the number of 11尾 - OHD patients , and it is difficult to form large - scale research . Genetic analysis of CYP11B1 gene was carried out by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R586

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