發(fā)布時(shí)間：2018-04-06 20:17

  本文選題：基因打靶　切入點(diǎn)：CRISPR/Cas　出處：《中國(guó)生物工程雜志》2017年01期

【摘要】：同源重組介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)因其準(zhǔn)確性高、引入的突變可以預(yù)測(cè),已經(jīng)成為功能基因組研究的重要工具。但是在真核生物體內(nèi),天然同源重組的概率極低,對(duì)后續(xù)的篩選和鑒別造成很大困擾。因此,建立一個(gè)廣譜性的高效篩選策略極為重要。研究基于"雙熒光"的可視化篩選,通過(guò)提高篩選效率,從而建立了一種顯著提高同源重組打靶效率的新策略。該策略以綠色熒光蛋白基因和新霉素基因?yàn)檎Y選標(biāo)記,以紅色熒光蛋白基因?yàn)樨?fù)篩選標(biāo)記。經(jīng)過(guò)G418篩選后,挑取僅表達(dá)綠色熒光蛋白的抗性克隆,用于跨界PCR檢測(cè)。研究嘗試運(yùn)用上述新策略,借助CRISPR/Cas9技術(shù),對(duì)豬肌抑素基因進(jìn)行同源重組介導(dǎo)的基因打靶。在選取的T1和T2兩個(gè)靶位點(diǎn)處,"雙熒光"策略篩選的細(xì)胞陽(yáng)性率分別達(dá)到80.5%和86.7%,篩選效率得到顯著提高。研究建立的"雙熒光"可視化篩選策略具有高效性和廣譜性,在動(dòng)物基因編輯領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Homologous recombination mediated gene targeting has become an important tool for functional genome research because of its high accuracy and predictive mutation.However, in eukaryotes, the probability of natural homologous recombination is very low, which is a major problem for subsequent screening and identification.Therefore, it is very important to establish a broad spectrum efficient screening strategy.The visual screening based on "double fluorescence" was studied. By improving the screening efficiency, a new strategy to improve the efficiency of homologous recombination shooting was established.In this strategy, green fluorescent protein gene and neomycin gene were used as positive screening markers and red fluorescent protein gene as negative screening marker.After G418 screening, the resistant clones expressing only green fluorescent protein were selected and used for cross-border PCR detection.The aim of this study was to target porcine myostatin gene by homologous recombination with CRISPR/Cas9.At the target sites of T1 and T2, the positive rates of cells screened by "double fluorescence" strategy were 80.5% and 86.7%, respectively, and the screening efficiency was improved significantly.The "double fluorescence" visual screening strategy developed in this paper has high efficiency and broad spectrum, and has a broad application prospect in animal gene editing field.
【作者單位】： 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院;湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院;
【基金】：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08006001-005,2016ZX08006002-006,2016ZX08010003-006) 湖北省科技支撐計(jì)劃(2014BBB010) 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心(2016-620-000-001-027)資助項(xiàng)目
【分類號(hào)】：Q78

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