本文選題：基因打靶　切入點：CRISPR/Cas　出處：《中國生物工程雜志》2017年01期

【摘要】：同源重組介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)因其準(zhǔn)確性高、引入的突變可以預(yù)測,已經(jīng)成為功能基因組研究的重要工具。但是在真核生物體內(nèi),天然同源重組的概率極低,對后續(xù)的篩選和鑒別造成很大困擾。因此,建立一個廣譜性的高效篩選策略極為重要。研究基于"雙熒光"的可視化篩選,通過提高篩選效率,從而建立了一種顯著提高同源重組打靶效率的新策略。該策略以綠色熒光蛋白基因和新霉素基因為正篩選標(biāo)記,以紅色熒光蛋白基因為負(fù)篩選標(biāo)記。經(jīng)過G418篩選后,挑取僅表達(dá)綠色熒光蛋白的抗性克隆,用于跨界PCR檢測。研究嘗試運用上述新策略,借助CRISPR/Cas9技術(shù),對豬肌抑素基因進(jìn)行同源重組介導(dǎo)的基因打靶。在選取的T1和T2兩個靶位點處,"雙熒光"策略篩選的細(xì)胞陽性率分別達(dá)到80.5%和86.7%,篩選效率得到顯著提高。研究建立的"雙熒光"可視化篩選策略具有高效性和廣譜性,在動物基因編輯領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Homologous recombination mediated gene targeting has become an important tool for functional genome research because of its high accuracy and predictive mutation.However, in eukaryotes, the probability of natural homologous recombination is very low, which is a major problem for subsequent screening and identification.Therefore, it is very important to establish a broad spectrum efficient screening strategy.The visual screening based on "double fluorescence" was studied. By improving the screening efficiency, a new strategy to improve the efficiency of homologous recombination shooting was established.In this strategy, green fluorescent protein gene and neomycin gene were used as positive screening markers and red fluorescent protein gene as negative screening marker.After G418 screening, the resistant clones expressing only green fluorescent protein were selected and used for cross-border PCR detection.The aim of this study was to target porcine myostatin gene by homologous recombination with CRISPR/Cas9.At the target sites of T1 and T2, the positive rates of cells screened by "double fluorescence" strategy were 80.5% and 86.7%, respectively, and the screening efficiency was improved significantly.The "double fluorescence" visual screening strategy developed in this paper has high efficiency and broad spectrum, and has a broad application prospect in animal gene editing field.
【作者單位】： 長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院;湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室;湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院;
【基金】：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08006001-005,2016ZX08006002-006,2016ZX08010003-006) 湖北省科技支撐計劃(2014BBB010) 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心(2016-620-000-001-027)資助項目
【分類號】：Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王鵬,王義琴,張利明,李文彬,孫勇如;植物的基因打靶[J];植物生理學(xué)通訊;2003年05期

2 李樂;朱曄榮;王勇;;植物基因打靶研究進(jìn)展[J];生物學(xué)通報;2007年12期

3 李珊珊;安書紅;劉昱輝;;植物基因打靶中正負(fù)篩選系統(tǒng)的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報;2011年06期

4 鄧初夏;基因打靶法在鼠胚胎干細(xì)胞中的運用——一種修飾老鼠基因組的新方法[J];自然科學(xué)進(jìn)展;1994年02期

5 戴旭明，傅繼梁;制備轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎干細(xì)胞基因打靶途徑研究現(xiàn)狀（續(xù)上期）[J];癌變.畸變.突變;1995年06期

6 王向東，童坦君;基因打靶及其應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1996年06期

7 施家琦，，夏家輝;真核生物中基因打靶的策略[J];生命科學(xué)研究;1999年02期

8 張秀海,孫勇如;植物基因打靶研究現(xiàn)狀[J];生物工程進(jìn)展;1999年04期

9 張路;;基因打靶獲諾獎[J];百科知識;2007年21期

10 余海若;;21世紀(jì)的生物技術(shù):基因打靶——記2007年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎[J];知識就是力量;2007年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 唐冬生;蔣泓;曾芳;王克振;黃永芬;梁沂梅;張細(xì)權(quán);;人工鋅指核酸酶誘導(dǎo)的多位點基因打靶的研究[A];中國動物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

2 杜榮;秦健;安曉榮;陳永福;;基因打靶的策略和應(yīng)用前景[A];全國動物生理生化第十次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

3 葉菲;朱劍;余潮;官杰;朱友林;;基因打靶技術(shù)及其應(yīng)用[A];湖北省遺傳學(xué)會、江西省遺傳學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2006年

4 李艷梅;陳慧梅;賈海芳;薛仁宇;貢成良;曹廣力;;家蠶絲腺表達(dá)hGM-CSF的絲素重鏈基因打靶[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（1）[C];2009年

5 章衛(wèi)平;;新型轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20生理功能和病理學(xué)作用的基因打靶研究[A];中國病理生理學(xué)會受體、腫瘤和免疫專業(yè)委員會聯(lián)合學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

6 李莉;任林柱;李占軍;閆森;高飛;賴良學(xué);歐陽紅生;逄大欣;;構(gòu)建檢測Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報告豬[A];全國動物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2010年

7 陳慧梅;李艷梅;張梅;薛仁宇;貢成良;曹廣力;;家蠶fibL片段為同源臂的基因打靶轉(zhuǎn)hGM-CSF基因家蠶[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（2）[C];2009年

8 楊曉;;基因打靶和功能基因組學(xué)[A];中國實驗動物學(xué)會青年科技協(xié)會第二屆學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2001年

9 章衛(wèi)平;;新型轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20生理功能和病理學(xué)作用的基因打靶研究[A];中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會及學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2010年

10 趙增明;逄大欣;歐陽松應(yīng);陳穎;聶代邦;唐小春;賴良學(xué);歐陽紅生;;豬胚胎成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與基因打靶[A];全國動物生理生化第九次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 本報記者 吳曉鵬邋實習(xí)記者 鐘嘯;小鼠搭橋[N];21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)報道;2007年

2 王雪飛;“基因打靶”研究為何獲獎[N];健康報;2007年

3 代忘;套不上籠頭的生命狂想曲[N];21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)報道;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 孫世惠;利用基因打靶制備生產(chǎn)人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因豬的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

2 冀群升;應(yīng)用基因打靶產(chǎn)生磷酸脂酶C-γ 1（PLC-γ 1）基因的定位突變導(dǎo)致小鼠在胚胎發(fā)生早期死亡[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1995年

3 龔振明;小鼠p16～(INK4a)基因外顯子1α胚胎干細(xì)胞打靶研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 趙宇航;ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN位點的基因打靶研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉慧;CRISPR/Cas9與ZFNs 介導(dǎo)牛MSTN位點基因打靶效率的比較研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 趙芳坤;實現(xiàn)黏附因子FimH在幽門螺桿菌中外膜展示[D];北京化工大學(xué);2015年

3 田雨晨;CRISPR/Cas9介導(dǎo)的hLf基因打靶牛β-酪蛋白位點方法的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

4 劉倩男;基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶研究[D];河南大學(xué);2015年

5 劉暢;CRISPR/CAS9與TALENs介導(dǎo)奶山羊β-酪蛋白位點基因打靶效率的比較研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

6 王星;Cas9介導(dǎo)的水牛奶相關(guān)基因的多位點基因打靶[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

7 楊李陽;基于基因打靶的綠色熒光絲轉(zhuǎn)基因家蠶研究[D];蘇州大學(xué);2011年

8 王克振;利用鋅指核酸酶的高效多位點基因打靶研究[D];暨南大學(xué);2009年

9 王小海;提高轉(zhuǎn)基因動物基因打靶效率的鋅指核酸酶技術(shù)體系的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

10 孫達(dá)權(quán);山羊乳腺特異性載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

本文編號：1718739