發(fā)布時間：2018-04-05 06:47

  本文選題：甘藍型油菜　切入點：ATG8　出處：《蘭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：自噬(Autophagy,AP)是真核生物在正常生長發(fā)育過程中或遭受生物和非生物脅迫時細胞質(zhì)組分降解并再利用的重要方式之一,其對于維持細胞穩(wěn)態(tài)平衡、發(fā)育模式重構(gòu)、自體免疫以及抗氧化脅迫等方面有非常重要作用。關(guān)于植物自噬的研究目前主要局限于植物營養(yǎng)生長過程和生物或非生物脅迫條件下細胞的自噬,而對于植物正常發(fā)育過程,如有性生殖過程中是否也有自噬活動發(fā)生以及功能還不清楚。ATG8(Autophagy related gene 8)是參與自噬活動中最重要的基因之一。此前,本課題組在電鏡下發(fā)現(xiàn)蜀葵和油菜花粉母細胞中存在類似自噬體或自噬泡的結(jié)構(gòu),并以甘藍型油菜為對象,從中克隆出擬南芥ATG8(AtATG8)的同源基因(BnATG8),并將其與綠色熒光蛋白基因(GFP)融合后導(dǎo)入油菜雄性可育(MF)和不育(MS)系,獲得相應(yīng)過表達系(命名為MFAG和MSAG)。初步研究發(fā)現(xiàn),與MF系比較,T1代MFAG(T1-MFAG)分枝數(shù)增多,株高和千粒重下降;與MS系比較,T1代MSAG(T1-MSAG)分枝數(shù)不變,但株高和千粒重增加。為了解這兩種轉(zhuǎn)基因系的遺傳穩(wěn)定性,本研究分別在2015和2016年對T2和T3代遺傳性做進一步分析。此外,還借助GFP標簽和自噬染色劑MDC對其花粉母細胞及根尖細胞自噬活動做初步分析。結(jié)果如下:(1)與MF相比,T2-MFAG和T3-MFAG的抽薹率、株高和千粒重顯著降低,相反分枝數(shù)增多;與MS相比,T2-MSAG和T3-MSAG的抽薹率、株高和千粒重都顯著提高,分枝數(shù)卻降低。T3與T2之間無顯著差異。(2)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),與MF相比,T2-MFAG和T3-MFAG花絲變短、花藥變小變癟且形態(tài)多樣,藥室數(shù)變少,花粉母細胞變,花粉數(shù)和生活力降低;與MS相比,T2-MSAG和T3-MSAG花絲變長、花藥變大變飽滿且形態(tài)似橢圓有規(guī)則,藥室都為4個,花粉母細胞增多,花粉粒數(shù)和生活力增高。(3)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),油菜自身BnATG8基因在所有品系花中都有表達,而在所有導(dǎo)入了外源BnATG8的轉(zhuǎn)基因系中,載體中攜帶BnATG8、GFP和HYG基因都有表達,但在不同個體內(nèi),表達水平存在差異。在野生型中這些基因均完全不表達。(4)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在MSAG和MFAG轉(zhuǎn)基因系的花粉母細胞、四分體和小孢子中都有GFP熒光,在花粉母細胞和小孢子中,熒光主要集中在細胞質(zhì)并靠近細胞膜邊緣,呈彌散狀態(tài)。在四分體中,熒光主要集中于細胞核周圍且呈明亮斑點狀。從花粉母細胞到小孢子階段熒光強度逐漸增強。(5)MDC染色觀察發(fā)現(xiàn),以上轉(zhuǎn)基因系與野生型的花粉母細胞、四分體和小孢子中都有藍色熒光出現(xiàn),但熒光都呈彌散狀分布。轉(zhuǎn)基因系與野生型之間在熒光強度和分布上無顯著差別。(6)抗逆性研究發(fā)現(xiàn),在T2和T3代中,與MS系相比,MSAG轉(zhuǎn)基因系耐鹽能力提高;與MF系相比,MFAG轉(zhuǎn)基因系耐鹽能力無明顯差異。以上結(jié)果表明:1)ATG8基因過表達對油菜的生長、育性和抗逆性,特別是育性有著非常重要的影響。2)轉(zhuǎn)基因系的性狀是可穩(wěn)定遺傳的,尤其是MSAG系,在生產(chǎn)實踐中可能具有一定應(yīng)用價值。
[Abstract]:Autophagy APs is one of the important ways for eukaryotes to degrade and reuse cytoplasmic components during normal growth and development or under biotic and abiotic stress.Self-immunity and anti-oxidation stress play a very important role.The research on plant autophagy is mainly limited to plant vegetative growth and autophagy under biological or abiotic stress.It is unclear whether autophagy related gene 8 is one of the most important genes involved in autophagy during sexual reproduction.Previously, under electron microscope, we found that there were autophagy or autophagic structures in pollen mother cells of hollyhock and rapeseed, and Brassica napus was taken as the object.The homologous gene BnATG8 of Arabidopsis thaliana ATG8 / AtATG8 was cloned and fused with green fluorescent protein gene (GFP) and introduced into male fertile mf and sterility MS lines of Brassica napus. The corresponding overexpression lines (named MFAG and MSAGN) were obtained.It was found that compared with MF line, the branch number of T1-MFAG increased, and the plant height and 1000-grain weight decreased, but the branch number of T1-MSAG of T1-MSAG of T1-MSAG was unchanged, but the plant height and 1000-grain weight increased.In order to understand the genetic stability of the two transgenic lines, the inheritance of T2 generation and T3 generation were further analyzed in 2015 and 2016, respectively.In addition, the autophagy activity of pollen mother cells and root tip cells was analyzed with GFP label and autophagy MDC.The results were as follows: (1) compared with MF, the bolting rate, plant height and 1000-grain weight of T2-MFAG and T3-MFAG decreased significantly, but the number of branches increased, and the bolting rate, plant height and 1000-grain weight of T2-MSAG and T3-MSAG increased significantly compared with those of MS.The morphological observation showed that compared with MF, the filaments of T2-MFAG and T3-MFAG became shorter, the anthers became smaller and more varied, the number of drug chambers decreased, the pollen mother cells changed, and the pollen number and viability decreased.Compared with MS, the filaments of T2-MSAG and T3-MSAG became longer, the anthers became larger and fuller, and the anthers appeared to be elliptical and regular. The results of RT-PCR analysis showed that the pollen mother cells increased, the pollen grains and viability increased.The BnATG8 gene of rape itself was expressed in flower of all lines, but in all transgenic lines with exogenous BnATG8, BnATG8GFP and HYG genes were expressed in the vector, but the expression levels were different in different bodies.The results of laser confocal microscopy showed that GFP fluorescence was found in the pollen mother cells, tetrad and microspores of MSAG and MFAG transgenic lines, and in the pollen mother cells and microspores in the pollen mother cells and microspores.Fluorescence was mainly concentrated in the cytoplasm and near the edge of cell membrane.In tetrad, the fluorescence was mainly around the nucleus and showed bright spots.From pollen mother cell to microspore stage, the fluorescence intensity increased gradually. MDC staining showed that blue fluorescence appeared in the tetrad and microspore of the above transgenic lines and wild type pollen mother cells, but the fluorescence was distributed in a dispersive form.There was no significant difference in fluorescence intensity and distribution between transgenic lines and wild-type lines. The results showed that in T2 and T3 generation, the salt tolerance of MSAG transgenic lines was higher than that of MS lines, but there was no significant difference between MFAG transgenic lines and MF lines.The results showed that the overexpression of the ATG8 gene had a very important effect on the growth, fertility and stress resistance of rape, especially on fertility. 2) the characters of transgenic lines were stable and hereditary, especially the MSAG lines.In the production practice may have certain application value.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S565.4

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本文編號：1713626