本文選題：布魯氏菌　切入點(diǎn)：突變株文庫(kù)　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由胞內(nèi)寄生的布魯氏菌(Brucella)引起的一種重要的人獸共患病。該病可導(dǎo)致懷孕動(dòng)物的流產(chǎn),人的波浪熱,流感樣癥狀,以及骨關(guān)節(jié)炎等,對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)以及人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害。目前,布魯氏菌的致病機(jī)制仍不明確,毒力相關(guān)基因的鑒定仍需進(jìn)一步完成。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的羊種布魯氏菌NI轉(zhuǎn)座子插入突變株文庫(kù),通過(guò)比較基因組學(xué)方法預(yù)測(cè)了布魯氏菌必需基因,并通過(guò)細(xì)胞感染試驗(yàn)在全基因組水平篩選了毒力相關(guān)基因。取本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的布魯氏菌(NI)株轉(zhuǎn)座子突變株文庫(kù)工作板分別滅活處理后,依次提取基因組、酶切基因組、將酶切產(chǎn)物自連接、反向PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,將獲得的序列與羊種布魯氏菌(NI)株全基因序列比對(duì)尋找轉(zhuǎn)座子在基因組中的插入位點(diǎn),最終從32,640個(gè)突變菌株文庫(kù)中成功測(cè)序了 10,832株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。從文庫(kù)中隨機(jī)選取20個(gè)已知插入位點(diǎn)的突變株按同樣程序重新測(cè)序并分析轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn),驗(yàn)證符合率為100%,提示獲得的插入位點(diǎn)信息準(zhǔn)確性良好。分析插入位點(diǎn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)均勻分布于布魯氏菌(NI)株全基因組。在已知突變位點(diǎn)的10,832個(gè)突變株中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入在基因內(nèi)有8,515株,其中5,330株(突變基因1,398個(gè))的突變位點(diǎn)位于染色體Ⅰ, 3,185株(突變基因883個(gè))的突變位點(diǎn)位于染色體Ⅱ;轉(zhuǎn)座子插入在基因間隔有2,317株,其中1,643個(gè)突變株(轉(zhuǎn)座子插入在723個(gè)基因間隔)插入位點(diǎn)在染色體Ⅰ,674個(gè)突變株(轉(zhuǎn)座子插入在325個(gè)基因間隔)在染色體Ⅱ。在染色體Ⅰ和染色體Ⅱ序列中,分別平均每304 bp和305 bp被轉(zhuǎn)座子插入1次,提示插入位點(diǎn)在已知突變株的覆蓋率良好。隨機(jī)轉(zhuǎn)座子突變株文庫(kù)中無(wú)轉(zhuǎn)座子插入的基因,提示可能為該細(xì)菌生存的必需基因。對(duì)10,832個(gè)已知突變位點(diǎn)的突變株進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌基因組中存在948個(gè)基因無(wú)轉(zhuǎn)座子插入,將其作為布魯氏菌候選基因。鑒于細(xì)菌必需基因在進(jìn)化上相對(duì)保守,本研究通過(guò)比較基因組學(xué)從948個(gè)候選基因預(yù)測(cè)了 183個(gè)布魯氏菌候選必需基因。該結(jié)果為進(jìn)一步鑒定布病治療新型藥物的靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。由于已知突變位點(diǎn)突變株中存在同位點(diǎn)插入和同基因多次插入現(xiàn)象,為了減少工作強(qiáng)度、提高鑒定效率,方便布魯氏菌基因功能和致病機(jī)制研究,通過(guò)去除同位點(diǎn)插入和同基因多次插入的突變株,將6,782個(gè)已知突變位點(diǎn)的突變株在96孔板內(nèi)按照次序重新布局排列,形成了覆蓋B.melitensis NI株全基因組71%開(kāi)放閱讀框(Openreading frame, ORF)的布魯氏菌突變株陣列。將突變株陣列分別感染鼠巨噬細(xì)胞,經(jīng)熒光抗體染色觀察初步用于布魯氏菌毒力相關(guān)基因篩選,經(jīng)兩輪試驗(yàn)后獲得275個(gè)影響布魯氏菌胞內(nèi)生存的基因。分析發(fā)現(xiàn),其中121個(gè)基因?yàn)榍捌趫?bào)道并已鑒定的布魯氏菌毒力相關(guān)基因,154個(gè)基因?yàn)楸狙芯渴状魏Y選獲得的潛在毒力基因(138個(gè)基因內(nèi),16個(gè)基因間隔,9個(gè)為基因內(nèi)和基因間隔均存在)。綜上所述,本研究獲得的含有10,832個(gè)已知轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的布魯氏菌(NI)株突變株文庫(kù),將為全基因組水平研究布魯氏菌基因功能和致病機(jī)制的研究提供便捷的資源。預(yù)測(cè)的183個(gè)布魯氏菌后選必需基因?qū)殍b定布病治療新型藥物的靶點(diǎn)提供依據(jù)。新發(fā)現(xiàn)的154個(gè)布魯氏菌毒力相關(guān)基因?qū)椴剪斒暇肿又虏C(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this paper , we found that there were 8,515 mutation sites in the genome . The results showed that there were 8,515 mutation sites in the genome . The results showed that there were 8,515 mutation sites in the genome . In conclusion , the library of the mutant strain ( NI ) containing 10,832 known transposon insertion sites will provide a convenient resource for the study of the gene function and pathogenic mechanism of brucella in the whole genome level .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1710575