本文選題：家蠅　切入點(diǎn)：差異基因　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：抗生素是獸醫(yī)臨床使用最廣泛的抗感染藥物,但因其廣泛不合理的使用,使得多種病原菌對(duì)其產(chǎn)生了抗性。為此,研發(fā)新型廣譜且不易產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代藥物已迫在眉睫,抗菌肽就屬于其中一類。自然界中的抗菌肽不僅來源于動(dòng)植物,也來源于昆蟲,家蠅抗菌肽因具有低毒、低耐藥性等諸多特點(diǎn),已引起了國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。利用基因工程技術(shù)對(duì)家蠅抗菌肽及其免疫反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)。本研究以牛多殺性巴氏桿菌和雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲構(gòu)建的抑制性消減文庫(kù)(SSH)中篩選得到的部分差異表達(dá)基因?yàn)榛A(chǔ),以其cDNA為模板,通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE-PCR)技術(shù)對(duì)三個(gè)差異基因進(jìn)行擴(kuò)增,拼接其全長(zhǎng)序列,并對(duì)全長(zhǎng)序列進(jìn)行Blast分析以及生物信息學(xué)分析。將其中兩個(gè)基因(即家蠅溶菌酶Ⅰ基因和家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Ⅰ基因)的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后通過T-A克隆方法克隆到pMD-18T載體上,成功構(gòu)建了陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。將篩選出的基因亞克隆至pET-32a原核表達(dá)載體中,成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并于大腸桿菌BL21(DE3)及Transetta(DE3)中獲得高效表達(dá),上述基因的表達(dá)產(chǎn)物純化后均獲得了融合蛋白。進(jìn)一步對(duì)純化產(chǎn)物的親和活性及體外抑菌活性進(jìn)行了研究。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)利用RACE-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出三個(gè)差異基因的全長(zhǎng)cDNA序列,其ORF序列大小分別為303bp,429bp,366bp。Blast分析結(jié)果表明家蠅溶菌酶Ⅰ基因(Md-LSZⅠ)與登錄號(hào)為XP_011292185.1的家蠅溶菌酶1類似物基因的同源性為98%(第44位,46位和73位不相同)。家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因(Md-CBPⅠ)與登錄號(hào)為XP_011296921.1的家蠅幼蟲表皮蛋白9類似物基因的同源性為98%(第89位不相同)。Md-FBPⅠ基因與登錄號(hào)為XP_011297661.1的家蠅果糖二磷酸醛縮酶基因的同源性為99%(第68位不相同);其中兩個(gè)基因(即家蠅溶菌酶Ⅰ基因和家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Ⅰ基因)生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示:Md-LSZⅠ基因共編碼143個(gè)氨基酸,理論等電點(diǎn)為5.22,為疏水性蛋白,生物活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)73位氨基酸位于磷酸化位點(diǎn)。Md-CBPⅠ基因共編碼122個(gè)氨基酸,理論等電點(diǎn)為5.63,為親水性蛋白,對(duì)保守型區(qū)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)89位氨基酸位于該基因保守基序中;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,β-折疊,無(wú)規(guī)則卷曲,α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)均為這兩種基因編碼蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)。(2)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Md-LSZⅠ和pET-32a-Md-CBPⅠ,并在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。其中Md-LSZⅠ基因的融合蛋白表達(dá)形式為包涵體蛋白,Md-CBPⅠ基因的表達(dá)形式為可溶性蛋白。將上述表達(dá)產(chǎn)物純化后均獲得條帶單一的融合蛋白。(3)Md-CBPⅠ融合蛋白的親和活性檢測(cè)結(jié)果表明Md-CBPⅠ融合蛋白對(duì)幾丁質(zhì)以及纖維素均有一定的結(jié)合作用,且對(duì)幾丁質(zhì)的結(jié)合作用相對(duì)較好。抑菌試驗(yàn)檢測(cè)表明,Md-LSZⅠ融合蛋白對(duì)雞源沙門氏菌有一定的抑菌作用,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無(wú)明顯抑菌作用。Md-CBPⅠ融合蛋白對(duì)以上三種病原菌均無(wú)明顯抑菌作用。以上研究成果不但對(duì)進(jìn)一步研究上述三種融合蛋白的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也對(duì)家蠅抗菌蛋白功能及相關(guān)功能免疫機(jī)制的研究提供了相關(guān)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1707422