本文選題：Fat-基因　切入點(diǎn)：真核表達(dá)載體　出處：《生物工程學(xué)報(bào)》2016年02期

【摘要】：為了建立無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)Fat-1基因綿羊細(xì)胞系,本研究將PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架載體,得到可刪除篩選標(biāo)記基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表達(dá)載體。體外轉(zhuǎn)錄合成phiC31整合酶mRNA并與線性化的pEGFP-N1-Fat-1載體共轉(zhuǎn)染綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,G418篩選得到表達(dá)綠色熒光的單克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre質(zhì)粒誘導(dǎo)Cre重組蛋白表達(dá),將純化后的Cre穿膜肽轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞,將熒光淬滅的細(xì)胞系擴(kuò)繁,提取基因組DNA,進(jìn)行PCR及測序鑒定,得到無標(biāo)記轉(zhuǎn)Fat-1基因綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系,為生產(chǎn)無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因綿羊奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to establish a sheep cell line with Fat-1 gene without screening marker gene, the Fat-1 gene cloned from PCR was synthesized and cloned into pN1-EGFP frame vector to obtain the pEGFP-N1-Fat-1 eukaryotic expression vector which could delete the screening marker gene.In vitro transcription synthesis of phiC31 integrase mRNA and co-transfection with linearized pEGFP-N1-Fat-1 vector into sheep fetal skin fibroblast cell line G418 were used to screen the expression of green fluorescent monoclonal, and then pET-28a-His-NLS-TAT-Cre plasmid was used to induce the expression of Cre recombinant protein.The purified Cre transduction peptide was transduced into monoclonal cells expressing green fluorescence. The fluorescent quenched cell line was expanded, genomic DNA was extracted and identified by PCR and sequencing. The unlabeled fetal fibroblast cell line of sheep fetal skin with Fat-1 gene was obtained.To lay a foundation for the production of transgenic sheep without screening marker genes.
【作者單位】： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：內(nèi)蒙古生物高科技項(xiàng)目(No.20030301)資助~~
【分類號】：Q78

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本文編號：1707189