發(fā)布時(shí)間：2018-04-03 20:27

  本文選題：類芽孢桿菌屬　切入點(diǎn)：地芽孢桿菌屬　出處：《華東理工大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：本研究從7株類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)和地芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.)菌種中篩選出Paenibacillus lautus (DSMZ 3035),Paenibacillus mucilaginosus (DSMZ24461)和Geobacillus kaustophilus (DSMZ 7263)三株產(chǎn)普魯蘭酶菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。首先在篩選培養(yǎng)基上確定了原始菌株普魯蘭酶酶活力,克隆了來源于菌株3035,24461和7263的普魯蘭酶基因(pulPL,pulPM,pulGK),其基因序列大小分別為2355 bp,1965bp和2157 bp。并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上提交了基因序列,其序列號(hào)分別為KT 876382,KT899326和KT 899327。對(duì)以上普魯蘭酶保守序列分析可知它們均屬于Ⅰ型普魯蘭酶。成功構(gòu)建重組菌BL21-pET-28a-PulPL,其重組普魯蘭酶3035-28a-PulPL的比活為13.56 U/mg,最適溫度為40℃,最適pH為7.0。成功構(gòu)建重組菌BL21-pET-28a-PulPM,可溶表達(dá)重組普魯蘭酶24461-28a-PulPM比活為220 U/mg,最適溫度為40℃,最適pH為6.0,在pH 6-9范圍內(nèi),酶活力較穩(wěn)定。24461-28a-PulPM酶活力較高,但在高溫下酶活損失較大,在45℃的T1/2為9 min。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)24461-28a-PulPM與工業(yè)化酶2wan的結(jié)構(gòu)相比少一個(gè)結(jié)構(gòu)域X45-X25,故而我們將X45-X25拼接至24461-28a-PulPM,并成功構(gòu)建嵌合酶重組菌BL21-2w-24461-Pul,拼接蛋白含955個(gè)氨基酸,最適溫度由40℃變?yōu)?5℃,最適pH由6.0變?yōu)?.0,在45℃的T1/2增加了10 mmin。構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌WB800N-pNW-PulGK,分泌重組蛋白7263-pnw-PulGK至發(fā)酵液上清中,7263-pnw-PulGK酶活力為5.18 U/mL,其最適溫度為65℃,最適pH為6.0,在高溫條件下,7263-pnw-PulGK仍能維持大部分酶活。利用海藻酸鈉包埋法對(duì)7263-pnw-PulGK進(jìn)行固定化,固定化酶在高溫下的耐熱性變高,且可使用多次。
[Abstract]:From 7 strains of Bacillus ( Paenibacillus sp . ) and Geobacillus sp . A recombinant strain BL21 - pET - 28a - PulP was successfully constructed . The optimum temperature was 40 鈩，

本文編號(hào)：1706781