本文選題：AT2基因　切入點：氨基轉移酶　出處：《新疆大學》2016年碩士論文

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一種全世界廣泛種植的園藝作物,新疆作為我國甜瓜的主產(chǎn)區(qū),種植面積大且品種資源豐富。但由于霜霉病(Pseudoperonospora cubensis Rostov.)的頻繁發(fā)生,造成甜瓜植株枯萎、死亡,很大程度上降低了甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì),嚴重制約甜瓜產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展。由于新疆栽培品種無霜霉病抗性,因此選育具霜霉病抗性甜瓜品種極為迫切。基因工程的迅速發(fā)展為植物抗病育種工作提供了非常有效的技術手段,通過研究植物自身的抗病基因來提高植物的抗病性,是控制病害安全理想的途徑。本實驗以甜瓜抗霜霉病基因AT2為研究對象,通過RT-PCR法從MR-1中克隆得到AT2,利用在線預測軟件等生物信息學方法對AT2及其編碼的酶蛋白序列進行二級結構預測分析;同時通過熒光定量PCR檢測AT2在甜瓜植株中的表達特性。構建p CAMBIA2300-AT2植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法同時對新疆感霜霉病甜瓜品種“老漢瓜”和煙草遺傳轉化,得到陽性轉基因甜瓜T0代及轉基因煙草T0、T1代,以此為實驗材料分析AT2基因的功能。主要研究結果如下:(1)AT2基因的克隆、序列分析及表達特性分析從抗霜霉病甜瓜品種MR-1中克隆得到了AT2的基因序列,經(jīng)分析,其c DNA全長為1229bp,共編碼401個氨基酸。與Gen Bank中甜瓜aminotransferase 2序列比對同源性達99%,根據(jù)氨基酸序列推測的蛋白結構中含有一個與抗病相關的5-磷酸吡哆醛位點GSQKAL和一個過氧化物體定位信號SRI位點;二級結構預測分析此蛋白包含18個β-折疊位點,15個α-螺旋位點。MR-1不同生長時期和不同部位AT2基因表達量均有不同:其中開花期AT2基因表達量最高;且葉片的AT2基因表達量顯著高于莖、根,這表明該基因隨著甜瓜的生長發(fā)育而表達升高,與植物發(fā)育時期光呼吸的動態(tài)變化趨勢相似。(2)AT2基因植物表達載體的構建構建了pCAMBIA2300-AT2載體,轉入農(nóng)桿菌EHA105。(3)AT2基因遺傳轉化對甜瓜外植體再生效率、抗生素篩選濃度均進行了優(yōu)化探索,確定了適合本實驗的甜瓜遺傳轉化條件。以感病甜瓜品種“老漢瓜”和模式植物煙草為實驗材料,通過農(nóng)桿菌介導法進行轉化,獲得3株陽性轉基因甜瓜、7株陽性轉基因煙草;經(jīng)q RT-PCR檢測,轉基因甜瓜、煙草T0代中AT2基因表達量均高于野生型。對轉基因煙草T0種子進行卡那霉素(Kan)抗性篩選并統(tǒng)計T1代幼苗的Kan抗性分離比,結果有5個株系的Tl代幼苗按3:1分離;并檢測到AT2基因,說明目的基因在T1代轉基因煙草中遺傳穩(wěn)定。(4)轉基因植株SGT活性檢測、抗病性鑒定及生理生化分析提取轉基因甜瓜、煙草葉片粗蛋白液,檢測轉基因植株中絲氨酸乙醛酸轉氨酶的活性。表明轉基因植株葉片中的SGT酶粗提液具有催化轉氨反應的能力,且顯著高于野生型。接菌實驗表明轉基因甜瓜對霜霉病具有一定抗性;轉基因煙草對靶斑病、赤星病的抗性高于野生型煙草;且接菌后轉基因植株葉片中SGT、GOX、SOD、GST、APX酶活性顯著高于野生型;H2O2含量升高。說明正處于脅迫狀態(tài)的轉基因植株有更強的防御能力。
[Abstract]:Muskmelon L . is a widely cultivated horticultural crop in the world . Xinjiang is the main production area of sweet melon in China . The planting area is large and the variety resources are abundant . However , Pseudoperonospora cubensis Rosicker is caused by downy mildew . The gene sequence of AT2 gene was cloned from MR - 1 by RT - PCR . ( 3 ) The genetic transformation of AT2 gene has been optimized for the regeneration efficiency and antibiotic screening concentration of sweet melon .

【學位授予單位】：新疆大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.5;Q943.2

【參考文獻】

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