本文選題：刺參　切入點(diǎn)：鹽度相關(guān)基因　出處：《大連海洋大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：刺參(Apostichopus japonicus)主要分布于我國(guó)北方沿海地區(qū),已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖品種產(chǎn)值最高的種類(lèi)之一,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和豐富的經(jīng)濟(jì)效益。刺參養(yǎng)殖池塘多位于潮間帶,夏季暴雨、旱季蒸發(fā)、冬季冰凍、潮汐變化等都會(huì)引起養(yǎng)殖池塘海水鹽度發(fā)生劇烈變化。因此開(kāi)展鹽度對(duì)刺參生理、生化以及分子調(diào)控機(jī)制的研究,以了解刺參的鹽度適應(yīng)過(guò)程,有助于刺參遺傳育種工作的進(jìn)一步開(kāi)展。本文通過(guò)測(cè)定鹽度脅迫下刺參生理生化指標(biāo),觀察各器官組織學(xué)的變化,研究鹽度相關(guān)基因表達(dá)量的變化,Na~+/K~+-ATPase基因的組織定位情況,為刺參鹽度適應(yīng)性的研究工作奠定基礎(chǔ),同時(shí)為培育耐低鹽刺參品系提供科學(xué)參考。試驗(yàn)?zāi)M雨季環(huán)境,鹽度變化分為三個(gè)階段:第一階段模擬突降大雨,鹽度由正常海水鹽度以每6小時(shí)降3個(gè)鹽度的速度降至鹽度18;第二階段模擬低鹽環(huán)境下不換水的情況,鹽度維持在18時(shí)保持96小時(shí);第三階段養(yǎng)殖池塘換水期,鹽度由18以相同速度升至正常鹽度,并保持24小時(shí)。結(jié)果顯示,各時(shí)間點(diǎn)刺參體腔液滲透壓、體腔液總蛋白濃度、Na~+、K~+、Cl 濃度與鹽度的變化趨勢(shì)一致。Na~+、K~+、Cl 濃度均在鹽度下降到18時(shí)達(dá)到最低值,而Ca~(2+)濃度在脅迫過(guò)程中持續(xù)上升。體腔液中Na~+/K~+-ATP酶活力在鹽度18并保持4天后顯著高于其他組(P0.05),這一系列變化反應(yīng)了Na~+/K~+-ATP酶在刺參鹽度適應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。鹽度脅迫對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力無(wú)顯著影響。不同鹽度脅迫下刺參各器官組織學(xué)變化的研究結(jié)果表明,鹽度對(duì)刺參的管足、腸和縱肌影響最為顯著。從組織學(xué)變化可以看出隨著鹽度的降低,組織的完整性破損程度越顯著,所有組織器官的損傷程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)更加惡化。在低鹽18,23,27脅迫下,刺參腸道、肌肉和管足出現(xiàn)了明顯的組織損傷。在低鹽度18和23脅迫下,刺參腸道結(jié)締組織受到損傷,且部分與黏膜上皮層分離。在管足組織上有明顯的變化,在低鹽18下,管足組織出現(xiàn)明顯損傷,結(jié)締組織腫脹,縱肌破裂。在高鹽40下,刺參管足組織呈脫水狀態(tài)。鹽度18和23脅迫下的呼吸樹(shù)組織中的內(nèi)寄生纖毛蟲(chóng)數(shù)量減少甚至消失。結(jié)果顯示低鹽脅迫對(duì)刺參造成的影響較高鹽顯著。利用刺參鹽度脅迫轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)數(shù)據(jù),從獲得的403個(gè)差異表達(dá)基因中篩選出10個(gè)物質(zhì)跨膜運(yùn)輸相關(guān)的鹽度相關(guān)基因(水通道蛋白、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、F型H~+-ATP酶、Na~+/K~+-ATP酶、電壓門(mén)控性鉀離子通道、鈣激活氯通道、神經(jīng)乙酰膽堿受體α-9亞基、鈉-氯依賴(lài)型SNP家族、甘氨酸受體α亞基、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸),進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。結(jié)果表明,不同基因在不同組織中表達(dá)情況存在較大差異。Na~+/K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATPase在腸道、呼吸樹(shù)組織中的變化趨勢(shì)一致,均在6小時(shí)達(dá)到最高值,說(shuō)明了這兩個(gè)基因可能是協(xié)同發(fā)揮作用的。鈉-氯依賴(lài)性SNF家族(Slc6a13)和甘氨酸受體(Gly R)都屬于神經(jīng)傳導(dǎo)受體,這兩個(gè)基因在刺參低鹽脅迫過(guò)程中各組織的表達(dá)量和變化趨勢(shì)基本一致。利用原位雜交的技術(shù)手段,研究低鹽脅迫下Na~+/K~+-ATPase基因在刺參各組織的陽(yáng)性雜交情況,結(jié)果表明Na~+/K~+-ATPase基因表達(dá)在特定的環(huán)境條件下具有組織特異性。在呼吸樹(shù)結(jié)締組織中均未出現(xiàn)Na~+/K~+-ATPase陽(yáng)性雜交位點(diǎn),說(shuō)明刺參的呼吸樹(shù)結(jié)締組織不是Na~+-K~+泵發(fā)揮作用的主要場(chǎng)所。脅迫過(guò)后觸手組織出現(xiàn)了Na~+/K~+-ATPase基因的陽(yáng)性位點(diǎn),刺參的結(jié)締組織與肌肉層連接間隙有陽(yáng)性位點(diǎn),這一結(jié)果與管足組織的研究結(jié)果近似,這兩種組織都是屬于刺參的水管系統(tǒng),可能在刺參鹽度適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
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本文編號(hào)：1698005