本文選題：檸條　切入點(diǎn)：維管組織　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：檸條集中分布在我國干旱和半干旱地區(qū),在形態(tài)、生理和分子水平均對干旱做出適應(yīng)性響應(yīng)。目前對其形態(tài)和生理水平的干旱適應(yīng)性特征已有較多報(bào)道,但分子水平的抗旱研究還處于起步階段。本研究針對檸條在干旱加劇條件下葉柄維管束和葉脈更加發(fā)達(dá)的形態(tài)特征,從分子水平探究葉脈分化發(fā)育關(guān)鍵基因CkERF2和CkCOV1在檸條維管組織中的功能,為擴(kuò)展深化檸條維管組織響應(yīng)干旱的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。論文獲得如下結(jié)果:(1)從檸條葉樣中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA,通過RT-PCR的方法克隆CkERF2基因,經(jīng)測序表明:克隆得到轉(zhuǎn)錄因子CkERF2序列756 bp,編碼252個(gè)氨基酸,通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫Blastn比對表明不同物種間該基因的同源性較高,并且所含的AP2結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)與擬南芥中的一致。(2)采用BL21大腸桿菌原核表達(dá)的方法產(chǎn)生融合蛋白,純化后作為免疫原,免疫實(shí)驗(yàn)用兔,獲得CkERF2兔源多克隆抗體,經(jīng)Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)多克隆抗體的特異性,結(jié)果表明,獲得的多克隆抗體可以特異性的與原核表達(dá)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng),并且原核表達(dá)蛋白大小以外的區(qū)域檢測不到信號(hào)。說明成功克隆到特異性較高的多克隆一抗。(3)以自然干旱梯度上的檸條葉樣為試驗(yàn)材料,通過qRT-PCR和Western Blotting技術(shù),分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測CkERF2及其蛋白的相對表達(dá)量,結(jié)果表明隨著干旱脅迫的加劇,檸條葉樣中CkERF2及其蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢。說明干旱脅迫時(shí),檸條CkERF2在基因水平和蛋白水平均做出響應(yīng)。(4)利用pCAMBIA1302載體中的GFP綠色熒光蛋白,構(gòu)建重組載體pCAMBIA1302-CkERF2,使CkERF2和GFP綠色熒光蛋白融合表達(dá),瞬時(shí)轉(zhuǎn)化30 d苗齡的本氏煙草,橫切和縱切煙草葉片主脈,熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,CkERF2蛋白定位于維管組織木質(zhì)部中,推測CkERF2可能在調(diào)控原形成層細(xì)胞向木質(zhì)部分化的過程中扮演重要角色。(5)構(gòu)建pGBKT7-CkERF2重組載體,將pGBKT7-CkERF2重組載體和pGADT7空載體轉(zhuǎn)化至酵母菌感受態(tài)細(xì)胞中,涂布在營養(yǎng)缺陷固體培養(yǎng)基上,觀察菌落生長狀況。酵母自激活實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化有pGBKT7-CkERF2和pGADT7載體的酵母菌,在三缺和四缺培養(yǎng)基上均能很好生長,并且在含有X-gal的四缺培養(yǎng)基中可以發(fā)生顏色反應(yīng),說明CkERF2具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,為后續(xù)尋找CkERF2的互作蛋白提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。(6)同克隆CkERF2相同的方法,從檸條葉樣中克隆得到CkCOV1基因長為946 bp的序列,其中開放閱讀框?yàn)?77 bp,編碼258個(gè)氨基酸,推測該蛋白分子量為28.84 KD,等電點(diǎn)為5.46,是一種疏水蛋白,并用生物信息學(xué)軟件MEGA 5構(gòu)建聚類樹分析該基因的親緣關(guān)系;最后利用qRT-PCR方法進(jìn)行檸條干旱脅迫下葉樣該基因表達(dá)水平的定量分析。隨著干旱的加劇,該基因在檸條葉樣中的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。表明檸條CkCOV1基因的下調(diào)表達(dá)與維管系統(tǒng)積極響應(yīng)干旱有關(guān)。綜合以上研究結(jié)果得出結(jié)論:檸條基因CkERF2和CkCOV1分別通過正向和負(fù)向調(diào)控方式在維管組織響應(yīng)干旱而致葉脈愈加發(fā)達(dá)的過程中起重要調(diào)控作用,尤其是轉(zhuǎn)錄因子基因CkERF2在干旱下檸條葉脈向木質(zhì)部分化和發(fā)育中起關(guān)鍵作用。
[Abstract]:The expression of CkERF2 , CkERF2 and CkCOV1 was studied by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western Blotting technique . ( 5 ) The recombinant vector pGBKT7 - CkERF2 was constructed . The recombinant vector pGBKT7 - CkERF2 and pGADT7 empty vector were transformed into yeast competent cells .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S793.3
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本文編號(hào)：1697653