本文選題：奶牛乳房炎　切入點(diǎn)：淺綠氣球菌　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛的一種常見(jiàn)疾病,在世界范圍內(nèi)給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病原微生物對(duì)乳腺的感染是奶牛乳房炎發(fā)生的主要原因,目前已報(bào)道的病原菌已經(jīng)超過(guò)150種。淺綠氣球菌作為一種環(huán)境微生物最早被認(rèn)為是奶牛皮膚上的共生菌,但近年來(lái)多個(gè)國(guó)家報(bào)道從臨床和亞臨床奶牛乳房炎的奶樣中分離到了這種細(xì)菌。但是至今為止這種細(xì)菌對(duì)奶牛乳腺致病性的強(qiáng)弱,以及它對(duì)奶牛乳腺免疫反應(yīng)的影響尚不清楚。因此本研究旨在對(duì)我國(guó)牛場(chǎng)亞臨床乳房炎中分離的淺綠氣球菌進(jìn)行表型和基因型分析,通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)闡明淺綠氣球菌對(duì)奶牛乳腺健康的影響以及作用機(jī)制。本研究從北京、天津和河北的19個(gè)牛場(chǎng)采集了 1008份亞臨床乳房炎奶樣,鑒定奶樣中的病原微生物,獲得淺綠氣球菌菌株,進(jìn)行生化試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn),并利用16SrRNA基因測(cè)序、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分型三種方法進(jìn)行亞型分析。結(jié)果表明:從10個(gè)牛場(chǎng)中分離到60株淺綠氣球菌,在亞臨床乳房炎病例中分離率為5.9%。生化結(jié)果顯示:淺綠氣球菌具有較高的表型多樣性,其中觸酶試驗(yàn)和VP試驗(yàn)結(jié)果與其他國(guó)家報(bào)道的結(jié)果有差異;藥物的最小抑菌濃度說(shuō)明大部分菌株(95.0%)均對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物敏感,超過(guò)半數(shù)的菌株對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、克林霉素和復(fù)方新諾明耐藥。16SrRNA基因分型將60株菌分為兩個(gè)亞型,分型能力較弱;PFGE和RAPD分型能將淺綠氣球菌分成多種亞型,且RAPD分型方法更適合菌株來(lái)源的追蹤,能將大部分來(lái)自同一牛場(chǎng)或地區(qū)的菌株劃分為同一亞型。淺綠氣球菌亞型分析表明我國(guó)牛場(chǎng)來(lái)源的淺綠氣球菌具有較高的基因多樣性。根據(jù)RAPD的分型結(jié)果,從9個(gè)主要亞型中隨機(jī)各選取1株菌進(jìn)行小鼠致死性試驗(yàn)。選出強(qiáng)毒株和弱毒株各1株,通過(guò)LDH試驗(yàn)分析淺綠氣球菌強(qiáng)、弱菌株對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bMECs)的細(xì)胞毒性,并研究該菌對(duì)bMECs粘附性和侵襲能力,利用掃描和透射電鏡觀察淺綠氣球菌強(qiáng)、弱毒株對(duì)bMECs形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:9株淺綠氣球菌中,菌株A.V.40(強(qiáng)毒株)對(duì)小鼠致死率顯著高于其他菌株,達(dá)90%;其余8株菌株對(duì)小鼠致死率均低于40%,其中菌株A.V.36(弱毒株)最低,只有10%。強(qiáng)毒株對(duì)bMECs具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,攻菌6h后LDH水平顯著高于對(duì)照組,而弱毒株的細(xì)胞毒性較弱。另外,強(qiáng)毒株對(duì)bMECs有很強(qiáng)的黏附性,攻菌30 min后即有10%的細(xì)菌黏附至細(xì)胞表面,2 h后細(xì)菌黏附已經(jīng)超過(guò)50%;強(qiáng)毒株還具有一定的侵襲能力,攻菌6 h后,9.7%的細(xì)菌侵襲至細(xì)胞內(nèi)部;而弱毒株的黏附力和侵襲力極弱。掃描和透射電鏡觀察:強(qiáng)毒株在短時(shí)間內(nèi)大量黏附至細(xì)胞表面,損傷細(xì)胞微絨毛,進(jìn)而損傷細(xì)胞膜和侵襲至細(xì)胞內(nèi)部,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹和空泡化,細(xì)胞核出現(xiàn)完全空泡化,細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)最終消失。利用熒光定量PCR檢測(cè)bMECs受到淺綠氣球菌感染后細(xì)胞內(nèi)Toll樣受體和主要細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:強(qiáng)毒株攻菌3 h內(nèi),TLR-2和IL-6 mRNA水平顯著升高,而TLR-4、IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA水平都在3-6h顯著升高;頭孢噻呋治療能夠顯著降低大部分Toll樣受體和細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量。弱毒株組細(xì)胞中Toll樣受體和細(xì)胞因子的mRNA也有少量升高,但遠(yuǎn)低于強(qiáng)毒株組。建立淺綠氣球菌感染的小鼠乳房炎模型,從體內(nèi)試驗(yàn)的角度比較該菌強(qiáng)、弱毒株的致病性以及頭孢噻呋和環(huán)丙沙星的治療效果。結(jié)果表明強(qiáng)毒株淺綠氣球菌能夠在小鼠乳腺中保持103CFU/乳腺的細(xì)菌水平,病理切片結(jié)果顯示強(qiáng)毒株引起小鼠乳腺?gòu)?qiáng)烈的炎性反應(yīng),大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),在第9天時(shí)乳腺組織完全被破壞,乳腺組織中TNF-α含量升高;而弱毒株引起的炎性反應(yīng)相對(duì)輕微,乳腺結(jié)構(gòu)完整。高劑量(30 mg/kg)頭孢噻呋和環(huán)丙沙星的殺菌效果明顯,能顯著降低乳腺組織中的細(xì)菌數(shù)量,保護(hù)乳腺組織。綜上所述,淺綠氣球菌在我國(guó)北京、天津和河北地區(qū)牛場(chǎng)亞臨床乳房炎病例中有一定的分離率,占5.9%,具有較多的表型和較高的基因型多樣性。強(qiáng)毒株能夠黏附、侵襲和損傷bMECs,引起bMECs免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈應(yīng)答反應(yīng);并且能夠引起小鼠乳腺的劇烈炎癥反應(yīng),損傷乳腺組織,但是抗生素治療效果較好。而弱毒株則對(duì)bMECs和小鼠乳腺組織危害較弱。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明淺綠氣球菌部分菌株對(duì)bMECs和小鼠乳腺具有很強(qiáng)的致病性,說(shuō)明這些強(qiáng)毒株也能夠引起奶牛乳腺感染和引發(fā)炎癥,損傷奶牛的泌乳功能;但是這一推論尚需要建立淺綠氣球菌奶牛乳房炎模型來(lái)驗(yàn)證。至此,我們分離鑒定我國(guó)19牛場(chǎng)中的淺綠氣球菌60株,并對(duì)該菌的基因型和表型進(jìn)行分析,還從體內(nèi)試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)闡明淺綠氣球菌強(qiáng)毒株對(duì)bMECs和小鼠乳腺引起損傷和出現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究率先研究淺綠氣球菌對(duì)奶牛乳腺健康的影響,為進(jìn)一步科學(xué)研究淺綠氣球菌奠定了良好的基礎(chǔ),也為淺綠氣球菌性奶牛乳房炎的防治提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:In this study , we collected 1008 samples of subclinical mastitis from 19 cattle farms in Beijing , Tianjin and Hebei . The results showed that the levels of Toll - like receptor and IL - 6 mRNA in the cells were significantly higher than those in the control group after 6 h of challenge . The results showed that the expression of Toll - like receptor and IL - 6 mRNA in the cells was significantly increased after 30 min . The results of this study showed that some strains of P . aeruginosa had a strong pathogenicity to bMECs and mouse mammary glands , which indicated that these virulent strains could also induce the mammary gland infection and cause inflammation and damage the lactation function of the cows .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋亞攀;楊利國(guó);;中國(guó)奶牛乳房炎防治研究進(jìn)展[J];中國(guó)奶牛;2010年12期

2 王新,張秀英;中藥治療奶牛乳房炎的研究現(xiàn)狀與展望[J];中國(guó)獸藥雜志;2004年02期

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本文編號(hào)：1695004