本文選題：奶牛乳房炎　切入點：淺綠氣球菌　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛的一種常見疾病,在世界范圍內(nèi)給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。病原微生物對乳腺的感染是奶牛乳房炎發(fā)生的主要原因,目前已報道的病原菌已經(jīng)超過150種。淺綠氣球菌作為一種環(huán)境微生物最早被認為是奶牛皮膚上的共生菌,但近年來多個國家報道從臨床和亞臨床奶牛乳房炎的奶樣中分離到了這種細菌。但是至今為止這種細菌對奶牛乳腺致病性的強弱,以及它對奶牛乳腺免疫反應(yīng)的影響尚不清楚。因此本研究旨在對我國牛場亞臨床乳房炎中分離的淺綠氣球菌進行表型和基因型分析,通過體內(nèi)和體外試驗闡明淺綠氣球菌對奶牛乳腺健康的影響以及作用機制。本研究從北京、天津和河北的19個牛場采集了 1008份亞臨床乳房炎奶樣,鑒定奶樣中的病原微生物,獲得淺綠氣球菌菌株,進行生化試驗和藥物敏感性試驗,并利用16SrRNA基因測序、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型和隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分型三種方法進行亞型分析。結(jié)果表明:從10個牛場中分離到60株淺綠氣球菌,在亞臨床乳房炎病例中分離率為5.9%。生化結(jié)果顯示:淺綠氣球菌具有較高的表型多樣性,其中觸酶試驗和VP試驗結(jié)果與其他國家報道的結(jié)果有差異;藥物的最小抑菌濃度說明大部分菌株(95.0%)均對β內(nèi)酰胺類藥物敏感,超過半數(shù)的菌株對鏈霉素、四環(huán)素、克林霉素和復方新諾明耐藥。16SrRNA基因分型將60株菌分為兩個亞型,分型能力較弱;PFGE和RAPD分型能將淺綠氣球菌分成多種亞型,且RAPD分型方法更適合菌株來源的追蹤,能將大部分來自同一牛場或地區(qū)的菌株劃分為同一亞型。淺綠氣球菌亞型分析表明我國牛場來源的淺綠氣球菌具有較高的基因多樣性。根據(jù)RAPD的分型結(jié)果,從9個主要亞型中隨機各選取1株菌進行小鼠致死性試驗。選出強毒株和弱毒株各1株,通過LDH試驗分析淺綠氣球菌強、弱菌株對奶牛乳腺上皮細胞(bMECs)的細胞毒性,并研究該菌對bMECs粘附性和侵襲能力,利用掃描和透射電鏡觀察淺綠氣球菌強、弱毒株對bMECs形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:9株淺綠氣球菌中,菌株A.V.40(強毒株)對小鼠致死率顯著高于其他菌株,達90%;其余8株菌株對小鼠致死率均低于40%,其中菌株A.V.36(弱毒株)最低,只有10%。強毒株對bMECs具有較強的細胞毒性,攻菌6h后LDH水平顯著高于對照組,而弱毒株的細胞毒性較弱。另外,強毒株對bMECs有很強的黏附性,攻菌30 min后即有10%的細菌黏附至細胞表面,2 h后細菌黏附已經(jīng)超過50%;強毒株還具有一定的侵襲能力,攻菌6 h后,9.7%的細菌侵襲至細胞內(nèi)部;而弱毒株的黏附力和侵襲力極弱。掃描和透射電鏡觀察:強毒株在短時間內(nèi)大量黏附至細胞表面,損傷細胞微絨毛,進而損傷細胞膜和侵襲至細胞內(nèi)部,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹和空泡化,細胞核出現(xiàn)完全空泡化,細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)最終消失。利用熒光定量PCR檢測bMECs受到淺綠氣球菌感染后細胞內(nèi)Toll樣受體和主要細胞因子mRNA的表達量。實驗結(jié)果顯示:強毒株攻菌3 h內(nèi),TLR-2和IL-6 mRNA水平顯著升高,而TLR-4、IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA水平都在3-6h顯著升高;頭孢噻呋治療能夠顯著降低大部分Toll樣受體和細胞因子mRNA的表達量。弱毒株組細胞中Toll樣受體和細胞因子的mRNA也有少量升高,但遠低于強毒株組。建立淺綠氣球菌感染的小鼠乳房炎模型,從體內(nèi)試驗的角度比較該菌強、弱毒株的致病性以及頭孢噻呋和環(huán)丙沙星的治療效果。結(jié)果表明強毒株淺綠氣球菌能夠在小鼠乳腺中保持103CFU/乳腺的細菌水平,病理切片結(jié)果顯示強毒株引起小鼠乳腺強烈的炎性反應(yīng),大量炎性細胞浸潤,在第9天時乳腺組織完全被破壞,乳腺組織中TNF-α含量升高;而弱毒株引起的炎性反應(yīng)相對輕微,乳腺結(jié)構(gòu)完整。高劑量(30 mg/kg)頭孢噻呋和環(huán)丙沙星的殺菌效果明顯,能顯著降低乳腺組織中的細菌數(shù)量,保護乳腺組織。綜上所述,淺綠氣球菌在我國北京、天津和河北地區(qū)牛場亞臨床乳房炎病例中有一定的分離率,占5.9%,具有較多的表型和較高的基因型多樣性。強毒株能夠黏附、侵襲和損傷bMECs,引起bMECs免疫系統(tǒng)的強烈應(yīng)答反應(yīng);并且能夠引起小鼠乳腺的劇烈炎癥反應(yīng),損傷乳腺組織,但是抗生素治療效果較好。而弱毒株則對bMECs和小鼠乳腺組織危害較弱。本研究的實驗結(jié)果表明淺綠氣球菌部分菌株對bMECs和小鼠乳腺具有很強的致病性,說明這些強毒株也能夠引起奶牛乳腺感染和引發(fā)炎癥,損傷奶牛的泌乳功能;但是這一推論尚需要建立淺綠氣球菌奶牛乳房炎模型來驗證。至此,我們分離鑒定我國19牛場中的淺綠氣球菌60株,并對該菌的基因型和表型進行分析,還從體內(nèi)試驗和體外實驗闡明淺綠氣球菌強毒株對bMECs和小鼠乳腺引起損傷和出現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究率先研究淺綠氣球菌對奶牛乳腺健康的影響,為進一步科學研究淺綠氣球菌奠定了良好的基礎(chǔ),也為淺綠氣球菌性奶牛乳房炎的防治提供了科學依據(jù)。
[Abstract]:In this study , we collected 1008 samples of subclinical mastitis from 19 cattle farms in Beijing , Tianjin and Hebei . The results showed that the levels of Toll - like receptor and IL - 6 mRNA in the cells were significantly higher than those in the control group after 6 h of challenge . The results showed that the expression of Toll - like receptor and IL - 6 mRNA in the cells was significantly increased after 30 min . The results of this study showed that some strains of P . aeruginosa had a strong pathogenicity to bMECs and mouse mammary glands , which indicated that these virulent strains could also induce the mammary gland infection and cause inflammation and damage the lactation function of the cows .

【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋亞攀;楊利國;;中國奶牛乳房炎防治研究進展[J];中國奶牛;2010年12期

2 王新,張秀英;中藥治療奶牛乳房炎的研究現(xiàn)狀與展望[J];中國獸藥雜志;2004年02期

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本文編號：1695004