本文選題：三角帆蚌　切入點：免疫基因　出處：《上海海洋大學》2016年碩士論文

【摘要】：本研究以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)為研究對象,根據(jù)構建的三角帆蚌外套膜轉錄組文庫中已標注的EST序列,應用cDNA末端快速擴增法(RACE)克隆了熱休克蛋白90基因(HcHSP90)、活化的蛋白激酶C1基因(HcRACK1)和富含亮氨酸重復序列基因(HcLRR)的cDNA序列全長,對其進行了生物信息學分析,并分析了三個基因的組織表達及在不同應激條件下應激后不同時間點的表達。結果如下:1.HcHSP90基因的分子特征及表達分析HcHSP90基因cDNA全長為2659bp(GenBank登錄號:KR633143),開放閱讀框(ORF)為2187bp,另外其5'-和3'-非翻譯區(qū)長度分別為101bp和371bp,其中3'非翻譯區(qū)具有AATAAA mRNA加尾信號及Poly(A)寡聚腺苷酸。開放閱讀框編碼728個氨基酸,蛋白分子量為83.7Ku,等電點為5.13。序列中不存在信號肽和跨膜結構。氨基酸序列分析表明,HcHSP90含有HSP90家族5個保守的序列標簽。同源比對分析顯示,該基因編碼的蛋白與褶紋冠蚌(Cristaria plicata)HSP90氨基酸序列的相似度最高,為83.93%。將所得的氨基酸序列與其他物種的HSP90的氨基酸序列進行多重序列比對,并構建系統(tǒng)樹,結果顯示,本實驗克隆所得HcHSP90基因與已發(fā)表的幾種軟體動物HSP90聚為一支。在非脅迫狀態(tài)下,HSP90基因在各個檢測器官(閉殼肌、斧足、肝胰腺、血淋巴、外套膜、鰓、性腺)中均有表達,在肝胰腺中的表達量最高,性腺次之,閉殼肌中表達量最低。在大多數(shù)組織中,HSP90 mRNA表達水平與對照組(15℃)相比在不同溫度處理(0,5,25,和35°C)均能顯著被誘導。閉殼肌和性腺中,HSP90 mRNA表達水平在5℃達到高峰(8.89倍,P0.01;2.0倍,P0.01);肝胰腺中,HSP90mRNA在0℃下顯著被抑制(0.29倍,P0.01);其余四種組織檢測到HSP90mRNA表達水平均在35℃達到峰值。暴露于不同濃度的重金屬鎘(50,100,和200μg/L),HSP90 mRNA在血淋巴和鰓的表達水平上調程度不同,但沒有明顯的劑量依賴性反應。當嗜水氣單胞桿菌侵染后,血淋巴中HSP90 mRNA表達上調,感染36h后達到高峰(12.14倍,P0.01),在鰓中,感染3h后表達顯著上調(3.24倍,P0.01),然后保持恒定,直到感染36h后恢復至感染前表達水平。2.HcRACK1基因的分子特征及表達分析HcRACK1基因cDNA全長為1249 bp,其中開放閱讀框957 bp,編碼318個氨基酸。蛋白質結構域分析顯示HcRACK1含有RACK1家族特有的7個WD40結構域。運用熒光定量PCR技術分析HcRACK1在非脅迫狀態(tài)下及受到嗜水氣單胞菌侵染和重金屬鎘暴露后相關組織表達量的變化。結果顯示,HcRACK1在各個組織中均有表達,其中閉殼肌中表達量最高;嗜水氣單胞菌侵染后,HcRACK1在血淋巴中的表達量逐漸上升,24 h時達到峰值,隨后下降;暴露在100μg/L濃度的重金屬鎘中,HcRACK1在肝胰腺中的表達量逐漸上升,在第3d達到峰值;血淋巴在第2d達到峰值,隨后下降;鰓中HcRACK1的表達量無明顯變化。3.HcLRR基因的分子特征及表達分析HcLRR基因cDNA全長為3492 bp,其中開放閱讀框2142 bp,編碼713個氨基酸,包含一段由25個氨基酸組成的信號肽和688個氨基酸組成的成熟肽,氨基酸序列分析顯示該序列存在跨膜結構,運用熒光定量PCR技術分析LRR在正常組織中及受到嗜水氣單胞菌侵染后相關組織表達量的變化。結果顯示,在非脅迫狀態(tài)下,LRR基因在斧足中表達量最高,在其他組織中幾乎不表達。嗜水氣單胞菌刺激侵染后可以看到斧足和肝胰腺中LRR基因表達顯著下調,而其他組織表達量在不同時間點均出現(xiàn)表達峰值,顯示能顯著被誘導。
[Abstract]:In this study, Hyriopsis cumingii (Hyriopsis cumingii) as the research object, according to the sequence of EST labeled Hyriopsis cumingii mantle transcriptome library construction in the application of rapid amplification of cDNA ends (RACE) clone the heat shock protein 90 gene (HcHSP90), protein kinase C1 gene activation (HcRACK1) and leucine rich repeat gene (HcLRR) full-length cDNA sequence, characterized by bioinformatics analysis, and analyzed the expression and expression of stress under different stress conditions at different time points after three gene organization. The results are as follows: analysis of full-length HcHSP90 gene cDNA 2659bp expression and molecular features of 1.HcHSP90 gene (GenBank accession No.: KR633143), the open reading frame (ORF) of 2187bp, the 5'- and 3'- untranslated region length were 101bp and 371bp, which has a AATAAA 3'untranslated region of mRNA signal and Poly (A) oligoadenylate open reading. Frame encoding 728 amino acids. The protein molecular weight is 83.7Ku and isoelectric point of signal peptide does not exist in the 5.13. sequence and transmembrane structure. The amino acid sequence analysis showed that HcHSP90 HSP90 family contains 5 conserved sequence tags. Homology analysis showed that the gene encoding the protein with c.plicata (Cristaria plicata HSP90) the amino acid sequence of the highest similarity to 83.93%. amino acid sequences obtained from other species of HSP90 multiple sequence alignment and phylogenetic tree, the results showed that the HcHSP90 gene and cloned in this experiment published several animal software HSP90 clustered into one clade. The stress in the presence of HSP90 gene in each detection of organ (axe foot, adductor muscle, hepatopancreas, hemolymph, mantle, gill, gonad) were expressed, expression in hepatopancreas is the highest, the second was the lowest in gonad and adductor muscle. In most groups The fabric, the expression level of HSP90 mRNA and the control group (15 C) were compared in different temperature treatment (0,5,25, and 35 C) were significantly induced. Adductor muscle and gonad, HSP90 mRNA expression level reached the peak at 5 degrees Celsius (8.89 times, 2 times, P0.01; P0.01); hepatopancreas. HSP90mRNA was inhibited significantly under 0 degrees (0.29 times P0.01); the other four tissues detected the expression level of HSP90mRNA reached the peak at 35 degrees Celsius. Exposure to cadmium in different concentrations (50100 and 200 g/L), HSP90 mRNA in the hemolymph of the gill and the expression level increased to different degrees, but no the reaction was dose dependent. When the Aeromonas hydrophila infection, expression of blood with Bazhong HSP90 mRNA, after 36h infection peaked (12.14 times P0.01), in the gills, significantly up-regulated after infection with 3H (3.24 times P0.01), and then kept constant, straight to the expression level of.2.HcRACK1 before infection gene recovery after 36h infection Analysis of full-length HcRACK1 gene cDNA was 1249 BP and the expression of molecular characteristics, including an ORF of 957 BP encoding 318 amino acids. The protein domain analysis showed that HcRACK1 contains 7 WD40 RACK1 motifs. Using fluorescence quantitative PCR analysis of HcRACK1 in non stress state and is addicted to the expression of related the organization of Aeromonas infection and cadmium exposure. The results showed that HcRACK1 expressed in all tissues, the expression of the adductor muscle was the highest; Aeromonas hydrophila infection, the expression of HcRACK1 in the hemolymph of the amount gradually increased and reached the peak of 24 h, then decreased; exposure to cadmium 100 g/L concentration in the expression of HcRACK1 in hepatopancreas weight increased gradually, and reached the peak at 3D and then decreased; hemolymph peak reached in 2D; the expression of HcRACK1 in gill had no significant change in.3.HcLRR gene Analysis of full-length HcLRR gene cDNA was 3492 BP and the expression of molecular characteristics, including an ORF of 2142 BP encoding 713 amino acids, containing a mature peptide composed of 25 amino acid signal peptide and 688 amino acids, amino acid sequence analysis showed that the sequence of transmembrane structure analysis of LRR in normal tissues and by the expression of related organization of Aeromonas hydrophila infection using fluorescence quantitative PCR. The results showed that the stress state in the presence of LRR gene in pelecypodium highest expression level, almost no expression in other tissues. Aeromonas hydrophila infection after stimulation can see the expression of pelecypodium and hepatopancreas the LRR gene was significantly down regulated, while other organizations expressed at different time points were shown to peak expression, was induced significantly.

【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：1685366