本文選題：牙鲆　切入點(diǎn)：性腺分化　出處：《上海海洋大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：性別決定是性腺發(fā)育和分化的基礎(chǔ)。在地球上脊椎動(dòng)物的整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化歷程中,魚類是較為低等的脊椎動(dòng)物,它分布最廣泛,種類最多樣,性別決定機(jī)制又具有原始性和可塑多樣性,涵蓋了迄今已知的所有脊椎動(dòng)物的性別決定模式,因此魚類具有承上啟下的關(guān)鍵性地位。魚類的性別表達(dá)分為性別決定和性別分化兩個(gè)過程,二者有不同之處又有相似點(diǎn)。其中性別決定是靜態(tài)的基因型決定因素,而性別分化則是動(dòng)態(tài)的程序性發(fā)生,產(chǎn)生精卵巢以及第二性征的事件。這兩個(gè)進(jìn)程是相互作用與平衡,最終表現(xiàn)出功能、形態(tài)和行為的雌性或雄性。通常雌、雄性基因型即產(chǎn)生雌、雄性的表現(xiàn)型。然而低級(jí)別的脊椎動(dòng)物,性腺發(fā)育分化中易受到外源因子的干擾,出現(xiàn)基因型與表現(xiàn)型的不統(tǒng)一。因此關(guān)于魚類性別決定和性別控制技術(shù)的研究,因其性別決定和性腺分化機(jī)制的多樣性和不穩(wěn)定性而具有廣闊的空間。牙鲆(Paralichthys olivaceus),隸屬鰈形目(Pleuronectiforms),其肉質(zhì)鮮嫩、生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一。在牙鲆養(yǎng)殖中,雌雄個(gè)體生長(zhǎng)存在明顯差異,雌性個(gè)體大而且生長(zhǎng)快。在其性腺分化期,許多環(huán)境因子如溫度、外源性激素等能影響其性腺分化,研究表明高溫能誘導(dǎo)其仔魚產(chǎn)生更多生理性雄魚,而外源性激素也能使其發(fā)生性反轉(zhuǎn)。因此,牙鲆是開展魚類性別決定和性腺分化機(jī)制研究的良好動(dòng)物模型。mi RNA存在于真核生物中,是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度很短,約18~24個(gè)核苷酸(個(gè)別不超過20個(gè)核苷酸)。廣泛存在于動(dòng)物、植物、線蟲、人等各種生物中,具有高度的進(jìn)化保守性、組織特異性。mi RNA是動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、疾病發(fā)生中關(guān)鍵的調(diào)控因子,到目前其在牙鲆性別決定和性腺發(fā)育中的調(diào)控作用的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室先前建立了牙鲆精卵巢mi RNA文庫,并通過第二代測(cè)序(NGS)技術(shù)和生物信息學(xué)方法鑒定了141個(gè)成熟mi RNA,篩選出一批在牙鲆雌雄性腺中不同或特異表達(dá)的mi RNA。在此基礎(chǔ)上,本章挑選了2個(gè)差異表達(dá)大的mi RNA(pol-mi R-26a,26b),通過公共數(shù)據(jù)庫的靶基因預(yù)測(cè)軟件Pic Tar、Target Scan等預(yù)測(cè)出pol-mi R-26a,26b有多個(gè)靶m RNA,挑選出了其中和性別決定和性腺分化相關(guān)的emx1(empty spiracles homeobox1)以及重要的雄性性別決定候選基因dmrt1(Doublesex and mab-3-related transcription factor 1)。按照查詢NCBI數(shù)據(jù)庫,本章設(shè)計(jì)并合成了dmrt1 3’UTR片段的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行連接PCR得到的dmrt1 3’UTR和psi CHECK-2載體,構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒;同時(shí)采用定點(diǎn)誘變法對(duì)dmrt1基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變,構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒,將其分別轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中構(gòu)建pol-mi R-26a,26b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pol-mi R-26a,26b與其靶基因dmrt1的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明:野生型質(zhì)粒psi CHECK-dmrt1-3’UTR與pol-mi R-26a,26b mimics組的熒光素酶活性極顯著低于psi CHECK-dmrt1-3’UTR與pol-mi R-26a,26b inhibitor組及blank和NC組(P0.01)。表明pol-mi R-26a,26b能通過與dmrt1的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合,切割降解靶基因從而使其熒光素酶活性減弱。接著本實(shí)驗(yàn)對(duì)emx1在牙鲆各組織和早期發(fā)育中的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果成功獲得一長(zhǎng)度為1127 bp的牙鲆emx1 c DNA序列,其中包括708 bp的開放閱讀框,編碼235個(gè)氨基酸。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),牙鲆emx1基因的氨基酸序列與雀鯛和花溕同源性最高,為95%,與其它物種如斑馬魚、墨西哥脂鯉、原雞、熱帶爪蟾、小鼠和人的同源性分別為87%、84%、83%、80%、72%和72%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,牙鲆Emx1蛋白與魚類Emx1緊密聚為一支。熒光定量PCR顯示,emx1基因在牙鲆卵巢中的表達(dá)量豐富,精巢中次之,而在其他各組織的表達(dá)量則較低。emx1在從原腸胚到孵化后10 d的牙鲆早期發(fā)育中也發(fā)現(xiàn)了相對(duì)較高的表達(dá),且在胚孔封閉和心跳期有最高的表達(dá)。該結(jié)果表明emx1基因很可能在牙鲆早期發(fā)育和生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。為了探討高溫和外源性激素對(duì)牙鲆性腺分化期pol-mi R-26a,26b及其靶基因表達(dá)的影響,通過高溫誘導(dǎo)和外源性激素處理性腺分化敏感期的牙鲆仔魚,并利用熒光定量PCR技術(shù)分析了pol-mi R-26a,26b、dmrt1、emx1在各處理組牙鲆中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分為17β-E2(17β-雌二醇)處理組、17α-MT(17α-甲基睪酮)處理組、28℃高溫誘導(dǎo)組和對(duì)照組,結(jié)果顯示:高溫能加快牙鲆的生長(zhǎng)速度,并且使魚的雄性率達(dá)到88.72%;17α-MT和17β-E2均能誘導(dǎo)牙鲆性逆轉(zhuǎn)。熒光定量PCR結(jié)果表明,pol-mi R-26a和26b的表達(dá)趨勢(shì)較為一致,二者在高溫誘導(dǎo)組和對(duì)照組的表達(dá)量較高,而在17α-MT和17β-E2處理組的表達(dá)量則較低。高溫誘導(dǎo)后emx1在牙鲆性腺中的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),但17α-MT和17β-E2處理對(duì)其表達(dá)量無顯著影響。而dmrt1在高溫誘導(dǎo)組和17α-MT處理組牙鲆性腺中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,其中高溫組中dmrt1的表達(dá)量是對(duì)照組的5.98倍(P0.05);而17β-E2處理組中dmrt1的表達(dá)則最低。表明高溫誘導(dǎo)魚類向雄性化發(fā)育可能與高溫能上調(diào)dmrt1基因的表達(dá)有關(guān)。此外,dmrt1在高溫組的表達(dá)量高于雄激素組,這可能與高溫組的牙鲆生長(zhǎng)較快,其體長(zhǎng)體重平均值均大于雄激素組有關(guān)。
[Abstract]:Sex determination is the basis of sexual gland development and differentiation . In the course of evolution of the whole system of vertebrate in the world , fish is a relatively low - class vertebrate , and it has the most extensive and diverse species , and the sex determination mechanism has primitive and plastic diversity . We identified 141 mature mi RNA by means of the second generation sequencing ( NGS ) technique and bioinformatics method , screened out a batch of mi RNA of different or specific expression in the male and female sex glands of the ichthys olivaceus . On the basis of this , two different expression large mi RNAs ( pol - mi R - 26a , 26b ) were selected , and the target gene prediction software Pic Tar , Target Scan and so on predicted pol - mi R - 26a , 26b . The results showed that the expression of the emx1 gene was significantly lower than that of the other species such as zebrafish , Mexican fat carp , original chicken , tropical claw toad , mouse and human . The results showed that the gene of the wild type plasmid ppsi CHECK - dmrt1 - 3 ' and pol - mi R - 26a , 26b had the highest expression level . The results showed that the expression of protein pol - mi R - 26a , 26b , dmrt1 and emx1 was significantly higher than that in the control group .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：1680380