發(fā)布時間：2018-03-27 04:40

  本文選題：CRISPR-Cas9　切入點：HBV轉基因小鼠　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年碩士論文

【摘要】：乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。根據世界衛(wèi)生組織的報道,全球約有2.4億的乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原陽性持續(xù)至少6個月),每年有超過68.8萬人死于慢性乙肝的并發(fā)癥,包括肝癌和肝硬化。乙肝疫苗的應用雖能預防乙型肝炎病毒的傳播,但對于乙型肝炎的治療仍然面臨諸多問題。一般認為,徹底清除宿主細胞內乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)是治愈乙肝的標準,然而目前常用的各種抗病毒療法均未能實現這一目的。最近出現的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9系統,因可以對任何物種基因組進行DNA的定點編輯且較先前的基因編輯技術更為簡單、快捷、高效,已為諸多難以實現根治的病毒性感染、遺傳病以及染色體缺陷等疾病的治療帶來了曙光。截至目前,包括本課題組在內的前期研究均已成功利用CRISPR-Cas9系統在HBV細胞模型及HBV高壓水動力小鼠模型中實現了對HBV復制與表達的高效抑制,從理論上證明了CRISPR-Cas9在清除乙肝病毒感染上的巨大應用價值。然而在對于相比以上模型更接近臨床患者的體內模型HBV轉基因小鼠來說,已有的方法均未取得明顯的效果,主要是由于缺乏高效安全的基因轉運載體。目前廣泛使用的CRISPR-Cas9系統為來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-SpCas9,這種CRISPR-SpCas9系統雖能利用慢病毒或腺病毒作為基因轉運載體,但這些載體病毒過高的免疫原性及易整合至宿主細胞基因組等缺陷大大限制了CRISPR-Cas9技術在基因治療上的應用。新型重組腺相關病毒載體(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)雖然被認為是最理想的基因治療載體,但CRISPR-Cas9系統中的SpCas9及必需控制元件的體積(7kbp)超過了rAAV的容量(4.5kbp),并不能利用rAAV包裝完整的CRISPR-Cas9系統。2015年5月,美國麻省理工大學的張峰實驗室發(fā)現了一種小型化的產自金黃色葡萄球菌的CRISPR-SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)系統,并成功利用rAAV介導該系統在體內對相應基因進行編輯。本次研究旨在利用重組腺相關病毒(rAAV)介導CRISPR-SaCas9系統(rAAV::CRISPR-SaCas9)實現對HBV轉基因小鼠體內HBV的復制與表達的高效抑制。同時進一步探究rAAV8::CRISPR-SaCas9系統在HBV轉基因小鼠體內抑制HBV復制與表達過程中的有效劑量、持續(xù)時間、抑制效果、對HBV DNA的剪切效率、脫靶效應以及對動物可能造成的相關損傷等方面的問題。1.篩選適用于CRISPR-SaCas9系統的高效HBV靶點本課題組在前期的研究中成功利用CRISPR-SpCas9抑制了HBV細胞模型及HBV高壓水動力小鼠模型中HBV的復制與表達。然而,與CRISPR-SpCas9靶點需要的PAM限制基序“NGG”不同,CRISPR-SaCas9靶點需要的PAM基序為“NNGRRT”。在缺乏gRNA靶點預測工具的情況下,我們需要對靶向HBV的靶點進行設計篩選。(1)建立新的HBV靶點設計方法為了得到適用于不同HBV基因型的SaCas9高效靶點,我們首先選取了26種不同基因型不同地區(qū)來源的HBV(A-G),并對這些不同類型HBV的基因組進行序列比對。再利用Vector NTI Advance 11.5.1軟件在高度保守基因區(qū)域的正負雙鏈查找出含PAM基序“NNGRRT”的位點。通過以上步驟,我們共找到21個符合要求的靶點。(2)靶向HBV高效靶點的篩選我們根據篩選出的靶點分別構建了21套相應的CRISPR-SaCas9表達載體,并將這些載體與含有HBV基因組的表達載體共轉入293T細胞中,通過對細胞上清中的HBV抗原及HBV DNA的含量的檢測及細胞活性的測定,分別評估帶有不同靶點的CRISPR-SaCas9系統對HBV的抑制效率及對細胞活性的影響。經過上述篩選,我們得到了對HBV抑制效率最高且對細胞活性沒有影響的gRNASa4系統。此外我們通過T7EI酶切證實了含有該系統對細胞內HBV DNA的剪切。2.利用rAAV8::CRISPR-SaCas9系統高效抑制HBV轉基因小鼠體內HBV的復制與表達(1)利用VIII型重組腺相關病毒包裝CRISPR-SaCas9系統不同血清型別的腺相關病毒具有不同的組織嗜性,其中VIII型重組腺相關病毒(rAAV8)可以特異地感染肝組織,對其他組織臟器的感染效率較低。為盡可能減少CRISPR-SaCas9系統對小鼠體內其他器官的影響,本研究選擇VIII型重組腺相關病毒(rAAV8)對CRISPR-SaCas9系統進行包裝。我們通過向HEK293細胞中同時轉染CRISPR-SaCas9表達載體、包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper,成功將帶有高效靶向HBV靶點的CRISPR-SaCas9系統包裝入rAAV8病毒中。用氯仿純化法提純收集到的病毒,根據點雜交實驗結果,純化后的病毒滴度達1×1012v.g./mL以上。(2)HBV轉基因小鼠體內乙肝病毒復制的評估經DNA測序及血清學檢測,本研究所用的HBV轉基因小鼠體內整合有1.28倍HBV全長基因組,血清中HBsAg的含量達到4,000-6,000 IU/m L,HBe Ag的含量達到800-1,000 S/CO,HBV DNA含量超過108v.g./m L,并且可以在肝組織中檢測到HBcAg的表達。(3)低劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9的抑制效果評估根據已有文獻,我們首先測試了低劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒(5×1010v.g./只)對4-6周齡雄性HBV轉基因小鼠體內HBV的抑制效果。通過對病毒復制和表達的各項指標進行連續(xù)的監(jiān)測結果顯示,該劑量的rAAV8::CRISPRSaCas9病毒并不能有效抑制HBV轉基因小鼠體內HBV的復制和表達。(4)高劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9抑制了小鼠體內的HBV的復制與表達在我們將rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒劑量提高至2×1011v.g./只后,實驗組小鼠血清中HBV標志物的含量出現持續(xù)下降:在連續(xù)兩次注射后的第38天,實驗組小鼠血清中HBsAg、HBe Ag的含量相比對照組分別下降62.96±7.59%和65.18±3.08%;血清中HBV DNA的含量相比對照組下降92.82±3.67%;通過對肝臟切片HBcAg免疫熒光結果的分析,我們發(fā)現全景掃描照片可以看出實驗組HBcAg的熒光強度顯著低于對照組,實驗組肝組織中HBcAg的含量相比對照組下降76.88±18.39%,;通過肝組織病理學檢測,我們在對照組小鼠肝組織中觀察到了明顯的炎性浸潤和肝細胞腫大,然而實驗組小鼠肝組織中卻未觀察到相應的炎性病理改變。通過T7EI酶切以及深度測序,我們證實了rAAV8::CRISPR-SaCas9對HBV轉基因小鼠肝臟中HBV基因組相應區(qū)域的剪切作用。此外,小鼠其他臟器的病理學檢測均未出現任何病理改變。本次研究也未能檢測到rAAV8::CRISPR-SaCas9的脫靶效應。綜上所述,我們篩選出了適用于小型化CRISPR-SaCas9系統的HBV高效靶點,并首次利用CRISPR-SaCas9系統實現了對HBV轉基因小鼠體內HBV DNA復制與表達的高效抑制。本次研究擴展了CRISPR-Cas9技術在抗病毒領域的應用范圍,也為今后利用CRISPR-Cas9基因編輯技術開展慢性乙肝的基因治療提供理論依據和技術支持。
[Abstract]:A new type of recombinant adeno - associated virus ( CRISPR - Cas9 ) has been successfully used in hepatitis B virus infection . In order to obtain the high efficiency target for HBV DNA in mice , we found that the recombinant adeno - associated virus ( rAAV8 ) can effectively inhibit HBV replication and expression ( 1 ) . ( 4 ) High - dose rAAV8 :: CRISPR - SaCas9 inhibited the replication and expression of HBV in mice . The levels of HBV markers in serum of experimental group decreased by 62.96 鹵 7.59 % and 65.18 鹵 3.08 % , respectively .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 Jie Wang;Zhong-Wei Xu;Shuang Liu;Rui-Yang Zhang;Shan-Long Ding;Xiao-Meng Xie;Lu Long;Xiang-Mei Chen;Hui Zhuang;Feng-Min Lu;;Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication[J];World Journal of Gastroenterology;2015年32期

2 吳慶洲;黎經緯;劉光澤;陳媚娟;李秀梅;孔祥平;;復制型HBV轉基因小鼠肝組織HBcAg分布特性分析[J];華南國防醫(yī)學雜志;2010年02期

3 孔祥平;吳慶洲;羅顯榮;胡蓮美;李秀梅;易學瑞;佟明華;周軍輝;劉光澤;;復制型HBV轉基因小鼠遺傳穩(wěn)定性研究[J];中國生物工程雜志;2008年05期

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本文編號：1669983