發(fā)布時(shí)間：2018-03-27 04:40

  本文選題：CRISPR-Cas9　切入點(diǎn)：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道,全球約有2.4億的乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原陽性持續(xù)至少6個月),每年有超過68.8萬人死于慢性乙肝的并發(fā)癥,包括肝癌和肝硬化。乙肝疫苗的應(yīng)用雖能預(yù)防乙型肝炎病毒的傳播,但對于乙型肝炎的治療仍然面臨諸多問題。一般認(rèn)為,徹底清除宿主細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)是治愈乙肝的標(biāo)準(zhǔn),然而目前常用的各種抗病毒療法均未能實(shí)現(xiàn)這一目的。最近出現(xiàn)的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9系統(tǒng),因可以對任何物種基因組進(jìn)行DNA的定點(diǎn)編輯且較先前的基因編輯技術(shù)更為簡單、快捷、高效,已為諸多難以實(shí)現(xiàn)根治的病毒性感染、遺傳病以及染色體缺陷等疾病的治療帶來了曙光。截至目前,包括本課題組在內(nèi)的前期研究均已成功利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在HBV細(xì)胞模型及HBV高壓水動力小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了對HBV復(fù)制與表達(dá)的高效抑制,從理論上證明了CRISPR-Cas9在清除乙肝病毒感染上的巨大應(yīng)用價(jià)值。然而在對于相比以上模型更接近臨床患者的體內(nèi)模型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠來說,已有的方法均未取得明顯的效果,主要是由于缺乏高效安全的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目前廣泛使用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)為來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-SpCas9,這種CRISPR-SpCas9系統(tǒng)雖能利用慢病毒或腺病毒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體,但這些載體病毒過高的免疫原性及易整合至宿主細(xì)胞基因組等缺陷大大限制了CRISPR-Cas9技術(shù)在基因治療上的應(yīng)用。新型重組腺相關(guān)病毒載體(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)雖然被認(rèn)為是最理想的基因治療載體,但CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的SpCas9及必需控制元件的體積(7kbp)超過了rAAV的容量(4.5kbp),并不能利用rAAV包裝完整的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。2015年5月,美國麻省理工大學(xué)的張峰實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種小型化的產(chǎn)自金黃色葡萄球菌的CRISPR-SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)系統(tǒng),并成功利用rAAV介導(dǎo)該系統(tǒng)在體內(nèi)對相應(yīng)基因進(jìn)行編輯。本次研究旨在利用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)介導(dǎo)CRISPR-SaCas9系統(tǒng)(rAAV::CRISPR-SaCas9)實(shí)現(xiàn)對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制與表達(dá)的高效抑制。同時(shí)進(jìn)一步探究rAAV8::CRISPR-SaCas9系統(tǒng)在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)抑制HBV復(fù)制與表達(dá)過程中的有效劑量、持續(xù)時(shí)間、抑制效果、對HBV DNA的剪切效率、脫靶效應(yīng)以及對動物可能造成的相關(guān)損傷等方面的問題。1.篩選適用于CRISPR-SaCas9系統(tǒng)的高效HBV靶點(diǎn)本課題組在前期的研究中成功利用CRISPR-SpCas9抑制了HBV細(xì)胞模型及HBV高壓水動力小鼠模型中HBV的復(fù)制與表達(dá)。然而,與CRISPR-SpCas9靶點(diǎn)需要的PAM限制基序“NGG”不同,CRISPR-SaCas9靶點(diǎn)需要的PAM基序?yàn)椤癗NGRRT”。在缺乏gRNA靶點(diǎn)預(yù)測工具的情況下,我們需要對靶向HBV的靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)篩選。(1)建立新的HBV靶點(diǎn)設(shè)計(jì)方法為了得到適用于不同HBV基因型的SaCas9高效靶點(diǎn),我們首先選取了26種不同基因型不同地區(qū)來源的HBV(A-G),并對這些不同類型HBV的基因組進(jìn)行序列比對。再利用Vector NTI Advance 11.5.1軟件在高度保守基因區(qū)域的正負(fù)雙鏈查找出含PAM基序“NNGRRT”的位點(diǎn)。通過以上步驟,我們共找到21個符合要求的靶點(diǎn)。(2)靶向HBV高效靶點(diǎn)的篩選我們根據(jù)篩選出的靶點(diǎn)分別構(gòu)建了21套相應(yīng)的CRISPR-SaCas9表達(dá)載體,并將這些載體與含有HBV基因組的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中,通過對細(xì)胞上清中的HBV抗原及HBV DNA的含量的檢測及細(xì)胞活性的測定,分別評估帶有不同靶點(diǎn)的CRISPR-SaCas9系統(tǒng)對HBV的抑制效率及對細(xì)胞活性的影響。經(jīng)過上述篩選,我們得到了對HBV抑制效率最高且對細(xì)胞活性沒有影響的gRNASa4系統(tǒng)。此外我們通過T7EI酶切證實(shí)了含有該系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的剪切。2.利用rAAV8::CRISPR-SaCas9系統(tǒng)高效抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制與表達(dá)(1)利用VIII型重組腺相關(guān)病毒包裝CRISPR-SaCas9系統(tǒng)不同血清型別的腺相關(guān)病毒具有不同的組織嗜性,其中VIII型重組腺相關(guān)病毒(rAAV8)可以特異地感染肝組織,對其他組織臟器的感染效率較低。為盡可能減少CRISPR-SaCas9系統(tǒng)對小鼠體內(nèi)其他器官的影響,本研究選擇VIII型重組腺相關(guān)病毒(rAAV8)對CRISPR-SaCas9系統(tǒng)進(jìn)行包裝。我們通過向HEK293細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染CRISPR-SaCas9表達(dá)載體、包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper,成功將帶有高效靶向HBV靶點(diǎn)的CRISPR-SaCas9系統(tǒng)包裝入rAAV8病毒中。用氯仿純化法提純收集到的病毒,根據(jù)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,純化后的病毒滴度達(dá)1×1012v.g./mL以上。(2)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的評估經(jīng)DNA測序及血清學(xué)檢測,本研究所用的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)整合有1.28倍HBV全長基因組,血清中HBsAg的含量達(dá)到4,000-6,000 IU/m L,HBe Ag的含量達(dá)到800-1,000 S/CO,HBV DNA含量超過108v.g./m L,并且可以在肝組織中檢測到HBcAg的表達(dá)。(3)低劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9的抑制效果評估根據(jù)已有文獻(xiàn),我們首先測試了低劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒(5×1010v.g./只)對4-6周齡雄性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的抑制效果。通過對病毒復(fù)制和表達(dá)的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測結(jié)果顯示,該劑量的rAAV8::CRISPRSaCas9病毒并不能有效抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制和表達(dá)。(4)高劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9抑制了小鼠體內(nèi)的HBV的復(fù)制與表達(dá)在我們將rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒劑量提高至2×1011v.g./只后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中HBV標(biāo)志物的含量出現(xiàn)持續(xù)下降:在連續(xù)兩次注射后的第38天,實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中HBsAg、HBe Ag的含量相比對照組分別下降62.96±7.59%和65.18±3.08%;血清中HBV DNA的含量相比對照組下降92.82±3.67%;通過對肝臟切片HBcAg免疫熒光結(jié)果的分析,我們發(fā)現(xiàn)全景掃描照片可以看出實(shí)驗(yàn)組HBcAg的熒光強(qiáng)度顯著低于對照組,實(shí)驗(yàn)組肝組織中HBcAg的含量相比對照組下降76.88±18.39%,;通過肝組織病理學(xué)檢測,我們在對照組小鼠肝組織中觀察到了明顯的炎性浸潤和肝細(xì)胞腫大,然而實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中卻未觀察到相應(yīng)的炎性病理改變。通過T7EI酶切以及深度測序,我們證實(shí)了rAAV8::CRISPR-SaCas9對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中HBV基因組相應(yīng)區(qū)域的剪切作用。此外,小鼠其他臟器的病理學(xué)檢測均未出現(xiàn)任何病理改變。本次研究也未能檢測到rAAV8::CRISPR-SaCas9的脫靶效應(yīng)。綜上所述,我們篩選出了適用于小型化CRISPR-SaCas9系統(tǒng)的HBV高效靶點(diǎn),并首次利用CRISPR-SaCas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV DNA復(fù)制與表達(dá)的高效抑制。本次研究擴(kuò)展了CRISPR-Cas9技術(shù)在抗病毒領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,也為今后利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)開展慢性乙肝的基因治療提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
[Abstract]:A new type of recombinant adeno - associated virus ( CRISPR - Cas9 ) has been successfully used in hepatitis B virus infection . In order to obtain the high efficiency target for HBV DNA in mice , we found that the recombinant adeno - associated virus ( rAAV8 ) can effectively inhibit HBV replication and expression ( 1 ) . ( 4 ) High - dose rAAV8 :: CRISPR - SaCas9 inhibited the replication and expression of HBV in mice . The levels of HBV markers in serum of experimental group decreased by 62.96 鹵 7.59 % and 65.18 鹵 3.08 % , respectively .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Jie Wang;Zhong-Wei Xu;Shuang Liu;Rui-Yang Zhang;Shan-Long Ding;Xiao-Meng Xie;Lu Long;Xiang-Mei Chen;Hui Zhuang;Feng-Min Lu;;Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication[J];World Journal of Gastroenterology;2015年32期

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4 劉光澤;孔祥平;任向榮;李秀梅;胡蓮美;黃黎珍;顧為望;;高復(fù)制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型對抗乙型肝炎病毒藥物的效應(yīng)研究[J];中國病理生理雜志;2007年01期

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本文編號：1669983