本文選題：家蠶　切入點：類胡蘿卜素加氧酶　出處：《西南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：類胡蘿卜素加氧酶(Carotene Oxygenase)是一種氧化酶,能夠氧化裂解類胡蘿卜素產(chǎn)生維生素A(Vitamin A,VA)類物質(zhì)。在動物體中,類胡蘿卜素的氧化裂解產(chǎn)物在視覺形成、細(xì)胞分化、免疫、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎和生殖發(fā)育等過程中都有著十分重要的作用。在缺失該酶的果蠅(Drosophila melanogaster)視覺突變體nina B中,維生素A和視網(wǎng)膜色素的含量比正常果蠅明顯減少,導(dǎo)致視覺喪失。而家蠶類胡蘿卜素加氧酶還未見研究報道。本研究鑒定了家蠶類胡蘿卜素加氧酶基因(Bmnina B),并通過RT-PCR、Real time PCR、Western blot及RNAi等技術(shù)對家蠶中該基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:1.家蠶BmninaB基因的克隆及鑒定根據(jù)已報道的果蠅和大蠟螟(Galleria mellonella)ninaB同源基因的序列信息,在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中確定位于第12號染色體nscaf2825上的BGIBMGA005193為其同源基因,但通過EST分析及克隆測序驗證,發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶基因組中起始位置注釋有誤,缺失了包括5’UTR在內(nèi)的兩個外顯子。最終確定家蠶Bmnina B基因有兩種m RNA剪切型:其中第一種剪切型Bmnina B-1由14個外顯子13個內(nèi)含子組成,全長m RNA為2153bp,其中編碼區(qū)1536bp,共編碼511個氨基酸;第二種剪切型Bmnina B-2編碼區(qū)1422bp,缺失了496~606位共111個堿基,引起表達(dá)蛋白第34位氨基酸由T突變?yōu)镹,并缺失35到71位共37個氨基酸殘基。2.家蠶BmninaB基因的時空表達(dá)模式檢測根據(jù)家蠶BmninaB基因的全長序列設(shè)計引物,通過RT-PCR及Real time PCR檢測家蠶Bmnina B基因在不同發(fā)育時期及五齡幼蟲各組織間的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶Bmnina B基因在未受精和受精后1天的卵中有高量表達(dá),隨后表達(dá)水平較低;在幼蟲期一直低水平表達(dá);在蛹蛾期家蠶Bmnina B基因的表達(dá)存在雌雄差異,在雌性個體中的表達(dá)量顯著高于雄性。五齡3天不同組織的表達(dá)模式檢測結(jié)果顯示,家蠶BmninaB基因在頭和生殖腺高量表達(dá),在其余檢測的8個組織中都只有少量表達(dá)。3.家蠶BmninaB的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備將家蠶Bmnina B全長CDS連入p ET-28a載體進(jìn)行原核表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有少量蛋白以可溶形式存在,大部分以包涵體的形式存在。將純化的包涵體作為抗原免疫新西蘭兔,制備多克隆抗體。末次免疫后抗血清經(jīng)ELISA檢測效價超過1:12800,經(jīng)過Western blot檢測特異性較好。進(jìn)一步檢測各組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)該蛋白在頭、卵巢、神經(jīng)中表達(dá)量較高,在脂肪體和中腸中也有表達(dá)。4.利用RNAi技術(shù)研究Bmnina B基因的功能體外轉(zhuǎn)錄合成用于干涉BmninaB基因的dsRNA,分別在上蔟后4天和6天注射雌蛹。在蛾期進(jìn)行解剖觀察和統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,上蔟6天注射的三個梯度(80μg、150μg、220μg)中實驗組同對照相比均沒有顯著差異,而上蔟4天的兩個注射梯度(150μg、250μg)中實驗組與對照組相比雌蛹造卵數(shù)顯著減少,同時干涉組未受精卵和死卵的數(shù)目增加。進(jìn)一步的分子水平檢測證實了干涉組Bmnina B在m RNA水平和蛋白水平的表達(dá)都顯著下調(diào)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張方;家蠶類胡蘿卜素加氧酶BmninaB基因的鑒定及功能研究[D];西南大學(xué);2016年

，

本文編號：1663293