本文選題：CryAc基因　切入點：煙草　出處：《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報》2017年12期

【摘要】：植物轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn),多拷貝插入往往導致外源基因表達量下降,但在構(gòu)建載體時將同一外源基因串聯(lián)構(gòu)建于同一載體上,轉(zhuǎn)化植株后是否會提高外源基因的表達量尚未報道。為了提高轉(zhuǎn)基因植物中外源目的基因的表達量,探索同一目的基因疊加對基因表達及轉(zhuǎn)基因植株生長的影響,本研究利用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的葉盤法分別將攜帶單、雙蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因Cry1Ac的植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum)組培苗,并對轉(zhuǎn)基因株系進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)、熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)(絕對定量)、Bt毒蛋白及抗蟲性檢測,以鑒定外源基因是否整合至煙草基因組及外源基因的表達情況,同時對兩種載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因植株進行形態(tài)及生理生化指標測定,觀測轉(zhuǎn)基因植株的生長情況。結(jié)果表明,通過PCR檢測,獲得轉(zhuǎn)單Cry1Ac基因株系9個,轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系8個,目的基因均整合至煙草基因組;熒光定量PCR及毒蛋白檢測表明,轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度約為轉(zhuǎn)單Cry1Ac株系的2.6倍,Cry1Ac毒蛋白含量約為轉(zhuǎn)單Cry1Ac基因株系的10倍,轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系的兩個數(shù)值都顯著高于轉(zhuǎn)單Cry1Ac基因株系;室內(nèi)飼蟲實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)兩種載體株系對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)一齡幼蟲和二齡幼蟲的致死率均為100%,轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系的致死時間較短;形態(tài)及生理生化指標測定結(jié)果表明,大部分轉(zhuǎn)基因株系的生長指標與對照無顯著差異,部分轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系表現(xiàn)出矮化現(xiàn)象。總體來說,本研究中轉(zhuǎn)雙Cry1Ac基因株系較轉(zhuǎn)單基因株系在外源基因表達量上得到提高,而在植株生長等方面未受到明顯影響。本研究為探索提高外源基因表達量的方法以及轉(zhuǎn)化其他植物提供基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Plant transgenic studies have found that multiple copy insertions often lead to a decrease in the amount of foreign gene expression, but the same foreign gene is constructed in tandem with the same vector when the vector is constructed. In order to increase the expression of exogenous genes in transgenic plants, the effects of superposition of the same target genes on gene expression and growth of transgenic plants were explored. In this study, Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disk method was used to transform the plant expression vector carrying single and double Bacillus thuringiensis BT gene Cry1Ac into Nicotiana tabacum. The transgenic lines were tested by polymerase chain reaction, fluorescence quantitative PCR(fluorescence quantitative PCR, FQ-PCRG (absolute quantification of BT toxin protein) and insecticidal resistance to identify whether the foreign gene was integrated into the tobacco genome and the expression of exogenous gene. At the same time, the morphological, physiological and biochemical indexes of transgenic lines and non-transgenic plants transformed by two vectors were determined, and the growth of transgenic plants was observed. The results showed that 9 transgenic Cry1Ac gene lines were obtained by PCR detection. All the target genes were integrated into tobacco genome, and fluorescence quantitative PCR and toxin protein detection showed that, The transcriptional abundance of the Cry1Ac gene in the transgenic double Cry1Ac line was about 2.6-fold of that of the single Cry1Ac strain, and the content of Cry1Ac toxin protein was about 10 times higher than that of the single Cry1Ac gene line, and the two values of the transgenic double Cry1Ac gene line were significantly higher than that of the single Cry1Ac gene line. The results of indoor feeding experiment showed that the mortality of the two vector lines against the first and second instar larvae of Helicoverpa armigera was 100, and the lethal time of transgenic double Cry1Ac gene lines was shorter, and the morphological, physiological and biochemical indexes were determined. There was no significant difference in growth indexes between most transgenic lines and the control, and some of the transgenic double Cry1Ac lines showed dwarfing phenomenon. In general, the expression of exogenous genes in the transgenic double Cry1Ac lines was higher than that in the single transgenic lines. This study provides a basic theoretical basis for exploring ways to increase the expression of exogenous genes and transforming other plants.
【作者單位】： 河北農(nóng)業(yè)大學林學院;河北省林木種質(zhì)資源與森林保護重點實驗室;
【基金】：國家自然科學基金項目(No.31370663和No.31660211) 河北省研究生創(chuàng)新資助項目(No.1099009)
【分類號】：Q943.2

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