發(fā)布時(shí)間：2018-03-22 09:00

  本文選題：西瓜　切入點(diǎn)：低溫脅迫　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：西瓜(Citrullus lanatus)是深受人們喜愛的水果之一,我國是世界上西瓜栽培面積和產(chǎn)量最大的國家。西瓜起源于非洲,喜溫喜光,對冷害較為敏感。設(shè)施早春栽培的西瓜時(shí)常會遇到低溫弱光的影響,造成幼苗長勢弱和后期生長不良,嚴(yán)重影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究西瓜低溫相關(guān)基因的功能可以為其耐低溫分子育種提供理論基礎(chǔ)。本文主要研究了西瓜交替氧化酶基因(ClAOX)及其多態(tài)性位點(diǎn)、凱氏帶形成相關(guān)基因(CICASPL)在低溫脅迫下的功能。本文采用簡并引物和基因組數(shù)據(jù)庫檢索的方式證明西瓜基因組中僅存在一個(gè)編碼交替氧化酶的基因。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贏OX2亞家族,基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。亞細(xì)胞定位、低溫誘導(dǎo)表達(dá)及組織特異性表達(dá)研究表明,ClAOX定位于線粒體,能夠被低溫脅迫誘導(dǎo),且在西瓜根、莖、葉、花、果實(shí)中具有不同的表達(dá)。CIA OX-promoter-gus轉(zhuǎn)基因系GUS染色結(jié)果表明,不同組織器官不同發(fā)育階段ClAOX表達(dá)不同。低溫誘導(dǎo)表達(dá)及組織發(fā)育特異性表達(dá)結(jié)果證明,西瓜ClAOX基因同時(shí)具備了AOX1和AOX2兩個(gè)亞家族的功能特征。對不同西瓜亞種、種間交替氧化酶基因克隆比對發(fā)現(xiàn),不同基因型西瓜間交替氧化酶基因存在豐富的多態(tài)性。飼用西瓜和普通栽培西瓜之間僅存在一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(K96、N96)。采用轉(zhuǎn)基因的方法對該位點(diǎn)功能進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：10℃低溫脅迫下,與ClAOXN相比ClAOXK具有更長的主根和更大的地上部鮮重,葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)也表明CIAOXK比ClAOXN更好的耐低溫特性。DAB、NBT染色顯示低溫脅迫后ROS積累ClA XN略多于ClAOXK。過氧化氫脫色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對外源過氧化氫的抗性,10℃C條件下處理后的植株抗性最強(qiáng),15℃次之,正常條件下生長的植株抗性最弱。各低溫脅迫下ClA XK對外源過氧化氫的抗性均優(yōu)于ClAOXN。這些結(jié)果表明,ClAOXK和ClAOXN對低溫抗性的差異可能與ROS信號通路密切相關(guān)。西瓜ClCASPL是從SHAM預(yù)處理后低溫脅迫下的西瓜葉片抑制性差減雜交文庫中篩選出的未知功能蛋白,該基因的同源基因AtCASPL4C1屬于CASP (UPF0497)基因家族。對西瓜中ClCASP家族研究發(fā)現(xiàn),該家族具有30個(gè)成員,分布于不同的染色體上。組織表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)不同家族成員在根、莖、葉花、果實(shí)具有不同的表達(dá)模式。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn),ClCASPL定位于細(xì)胞膜上；GUS染色結(jié)果表明,ClCASPL同源基因AtCASPL4C1普遍表達(dá)于各組織器官中,且能被低溫誘導(dǎo)表達(dá)。凱氏帶染色發(fā)現(xiàn)AtCASPL4C1缺失或者ClCASPL基因過表達(dá)均未影響根系凱氏帶的形成。低溫誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn),ClCASPL及其同源基因AtCASPL4C1均能夠被低溫脅迫不同程度誘導(dǎo)表達(dá)。采用擬南芥轉(zhuǎn)基因系研究發(fā)現(xiàn),ClCASPL及其同源基因AtCASPL4C1負(fù)調(diào)控植株的發(fā)育和低溫抗性。采用擬南芥突變體研究發(fā)現(xiàn)AtAOX2基因缺失能夠顯著抑制ClCASPL同源基因AtCASPL4C1在葉片中的表達(dá)。通過對西瓜AOX和CASP兩個(gè)家族基因功能的研究不僅能夠?yàn)槲鞴夏偷蜏赜N提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也能將交替氧化途徑與凱氏帶發(fā)育及功能發(fā)揮相關(guān)聯(lián)。
[Abstract]:Watermelon (Citrullus lanatus) is one of the favorite fruit is watermelon, China's cultivated area and output of the largest country in the world. Watermelon originated in Africa, warm like light is sensitive to chilling injury, early spring cultivation of watermelon. The facility often encountered in low temperature and weak light, resulting in weak seedling growth and late growth, seriously affect the yield and quality of watermelon watermelon. Low temperature related genes can provide a theoretical basis for the molecular breeding of low temperature resistance. This paper mainly studies the watermelon alternative oxidase gene (ClAOX) and its related gene polymorphism sites, formation of Casparian strips (CICASPL) under low temperature stress. This paper using degenerate primers and genome database search. That there is only one alternative oxidase gene encoding the watermelon genome. Phylogenetic analysis showed that this gene belongs to AOX2 subfamily, gene structure Analysis showed that this gene has 4 exons and 3 introns. The subcellular localization of low temperature induced expression and tissue specific expression studies showed that ClAOX was localized to the mitochondria, can be induced by low temperature stress, and the watermelon root, stem, leaf, flower,.CIA OX-promoter-gus transgenic GUS staining indicated that the expression is different in the fruit, different expression in different organs at different developmental stages of ClAOX. Low temperature induced expression and tissue specific expression of development results show that watermelon ClAOX gene simultaneously has the function characteristics of AOX1 and AOX2 two subfamilies. The different subspecies of watermelon, interspecific alternative oxidase gene cloning than the discovery of alternative oxidase gene polymorphism of the rich the different genotypes of watermelon. Only a single nucleotide polymorphism between forage and cultivated watermelon watermelon (K96, N96). The work method of transgenic loci To verify the findings: 10 DEG C under low temperature stress, compared with ClAOXN, ClAOXK has a longer taproot and greater shoot fresh weight, chlorophyll fluorescence data also show that CIAOXK is better than ClAOXN in the low temperature resistant properties of.DAB, NBT staining showed that the ROS ClA XN after low temperature stress accumulated slightly more than ClAOXK. hydrogen peroxide bleaching test found that low temperature pretreatment can to improve the resistance of transgenic plants to exogenous hydrogen peroxide plant, the strongest resistance after treatment 10 DEG C under the condition of 15 DEG C, the second, the resistance was the weakest growth under normal conditions. The resistance of hydrogen peroxide under the low temperature stress ClA XK external source are better than those of ClAOXN.. These results indicate that the ClAOXK and ClAOXN difference of low temperature resistance may with the ROS signaling pathway. ClCASPL is closely related to watermelon watermelon leaves from SHAM pretreated under low temperature stress suppression subtractive hybridization screening of proteins of unknown function in the library. Homologous gene AtCASPL4C1 belongs to CASP (UPF0497) gene family. The research findings in watermelon ClCASP family, the family has 30 members, located in different chromosomes. The expression was found in different family members in the roots, stems, leaves, flowers, fruits with different expression patterns. The study found that the subcellular localization, ClCASPL localization in the cell membrane; GUS staining indicated that ClCASPL homologous gene AtCASPL4C1 is ubiquitously expressed in various tissues and organs, and can be induced by low temperature. The expression of Casparian strips were found missing AtCASPL4C1 or ClCASPL gene expression did not affect the root formation of Casparian strips. Low temperature induced expression of ClCASPL homologous gene and found that AtCASPL4C1 can expression was induced in different degrees. The low temperature stress in Arabidopsis transgenic lines showed that homologous ClCASPL gene AtCASPL4C1 and its negative regulation of plant development and low temperature resistance The study found. Arabidopsis mutant expression deletion of AtAOX2 gene can inhibit the ClCASPL homologous gene AtCASPL4C1 in the leaves. Based on the research of AOX and CASP two family watermelon gene function can not only provide the theoretical basis for the breeding of cold resistant watermelon, but also will alternate oxidation pathway and Kjeldahl and function associated with development.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S651

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本文編號：1647956