本文選題：豬　切入點(diǎn)：多能性轉(zhuǎn)錄因子　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)自誕生以來,由于和胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)一樣既有自我更新、無限增殖能力,又有分化形成機(jī)體幾乎全部類型細(xì)胞的潛能,在再生醫(yī)學(xué)、畜禽種質(zhì)資源保護(hù)與創(chuàng)新和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等方面極具應(yīng)用價(jià)值,因而迅速成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的前沿?zé)狳c(diǎn)。如今,人們已成功獲得了包括豬在內(nèi)的多種家養(yǎng)動(dòng)物的iPSCs,打破了長期未能獲取豬和其它家畜真正ESCs的窘境。然而,iPSCs仍面臨質(zhì)量參差不齊、效率低和安全性不確定等突出問題。利用重組蛋白或小分子化合物誘導(dǎo)iPSCs為克服外源基因插入所可能導(dǎo)致的安全隱患奠定了良好基礎(chǔ)。但至今關(guān)于重組蛋白誘導(dǎo)豬iPSCs的報(bào)道十分有限。本研究將分別構(gòu)建豬LIN28、KLF4、c-MYC和OCT4四種基因與細(xì)胞穿膜肽11R融合表達(dá)的原核載體,并重點(diǎn)探討制備豬LIN28-11R可溶性融合重組蛋白的優(yōu)化條件,同時(shí)對(duì)另三種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行初步探索,以期為今后利用這四種重組蛋白誘導(dǎo)獲取豬iPSCs奠定基礎(chǔ)。具體試驗(yàn)及結(jié)果如下:1.豬LIN28、KLF4、c-MYC及OCT4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定。首先,用Optimum Gene軟件對(duì)豬OCT4(NP_001106531)、KLF4(NP_001026952)、c-MYC(NP_001005154)、LIN28(NP_001116605)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并在目的基因3’端加上編碼Linker和穿膜肽11R的基因序列。通過人工合成的方法獲得目的基因,再亞克隆至pET30a載體中。酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明,成功構(gòu)建出pET30a-NdeI-Oct4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-Lin28-linker-11R-XhoI-His、pET30a-Nde I-Klf4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-c-Myc-linker-11R-Xho I-His四種穿膜肽與多能性轉(zhuǎn)錄因子融合表達(dá)的原核載體。2.豬源LIN28-11R重組蛋白制備及其它三種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步探索。將重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,在不同的時(shí)間和溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá),篩選出LIN28-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件,并進(jìn)行大量表達(dá);蛋白產(chǎn)物經(jīng)純化和鑒定后進(jìn)行細(xì)胞穿膜添加實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證其是否具有穿透細(xì)胞膜的能力。同時(shí),對(duì)另外三種多能性因子重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。本試驗(yàn)最終獲得并純化出了可溶性的豬LIN28-11R重組蛋白,該重組蛋白具有穿透細(xì)胞膜的能力。而初步研究發(fā)現(xiàn),OCT4-11R、KLF4-11R和c-MYC-11R三種重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件可能是:KLF4-11R在37℃誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高,并在菌體裂解液上清中表達(dá)量較高;c-MYC-11R在37℃誘導(dǎo)4h的條件下有表達(dá),且只在菌體裂解液及裂解液沉淀中表達(dá);OCT4-11R在不同溫度(37℃、30℃)條件下幾乎均未表達(dá)�？傊�,本研究成功構(gòu)建了豬LIN28、KLF4、c-MYC和OCT4多能性轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞穿膜肽融合表達(dá)的原核載體,成功表達(dá)純化出了豬LIN28-11R可溶性融合重組蛋白,且融合蛋白具有穿透細(xì)胞膜的能力。此外,初步確定了OCT4-11R、KLF4-11R和c-MYC-11R三種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件。本研究為其它重組蛋白的制備提供了依據(jù),并為今后利用重組蛋白誘導(dǎo)豬iPSCs奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Induced pluripotent stem cells (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs) since its birth, and because embryonic stem cells (Embryonic Stem Cells, ESCs) as both self-renewal, unlimited proliferation, differentiation and formation of the body almost all cell types in the potential for regenerative medicine, animal protection and innovation of germplasm resources and biology the basic research of high value, which quickly became the hotspot in the field of life science. Nowadays, people have been successfully obtained including pigs including a variety of domestic animal iPSCs, breaking the long failed to get real ESCs the dilemma of pigs and other livestock. However, iPSCs still faces uneven quality, low efficiency and safety determination of the outstanding problems. Induction of iPSCs laid a good foundation for security risks could lead to overcome foreign gene insertion using recombinant protein or small molecule compounds. So far about pigs induced by iPSCs recombinant protein reported is very limited. This study will construct porcine LIN28, KLF4, prokaryotic vector c-MYC and OCT4 four kinds of gene and cell penetrating peptide 11R fusion expression, and focus on the optimization conditions of preparation of porcine LIN28-11R soluble fusion recombinant protein expression, while the other three conditions of transcription the recombinant protein factor are explored, with a view to the future use of the four kinds of recombinant porcine iPSCs. Get laid the foundation concrete trials and results are as follows: 1. porcine LIN28, KLF4, and the carrier phase to construct the prokaryotic expression of c-MYC gene and OCT4 gene of porcine OCT4. Firstly, using Optimum Gene software (NP_001106531). KLF4 (NP_001026952), c-MYC (NP_001005154), LIN28 (NP_001116605) gene sequence of codon optimization, and in the 3 'end with gene encoding Linker and transmembrane peptide 11R gene sequences obtained by synthetic methods. The target gene, and then subcloned into pET30a vector. Enzyme digestion and sequencing results showed that successfully constructed pET30a-NdeI-Oct4-linker-11R-XhoI-His, pET30a-NdeI-Lin28-linker-11R-XhoI-His, pET30a-Nde I-Klf4-linker-11R-XhoI-His, pET30a-NdeI-c-Myc-linker-11R-Xho I-His four cell penetrating peptides and can explore the expression conditions of induced transcription factor fusion protein prokaryotic vector.2. of porcine LIN28-11R and other recombinant protein preparation three kinds of transcription factors of the recombinant protein. The reconstructed plasmid transformed into E.coli BL21 and induced expression in time and different temperature conditions, screening of recombinant protein LIN28-11R optimal expression conditions, and a number of expression; protein after purification and identification of cell penetrating addition experiments to verify its ability penetrate the cell membrane. At the same time, for the other three pluripotency by recombinant Explores the expression conditions of protein. This experiment obtained and purified soluble recombinant protein of porcine LIN28-11R, the recombinant protein has the ability to penetrate cell membranes and OCT4-11R. The preliminary study found that, three kinds of recombinant protein KLF4-11R and c-MYC-11R induce the expression of the best conditions may be relatively high expression of KLF4-11R in 37 C induced by 4h, and high expression in cell lysate supernatant; expression of c-MYC-11R at 37 DEG 4H induced conditions, and only expressed in cell lysate and lysate precipitation; OCT4-11R at different temperature (37 DEG, 30 DEG C) condition are almost no expression. In conclusion, this study the successful construction of porcine LIN28, KLF4, c-MYC and OCT4 can be prokaryotic transcription factors and cell penetrating peptide fusion protein, successfully expressed and purified porcine LIN28-11R soluble fusion recombinant protein and fusion protein with penetration The ability of cell membrane was also identified. In addition, the induced expression conditions of three transcription factors, OCT4-11R, KLF4-11R and c-MYC-11R, were preliminarily determined. This study provides a basis for the preparation of other recombinant proteins, and lays the foundation for the future use of recombinant protein to induce pig iPSCs.

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1641012