發(fā)布時間：2018-03-20 18:56

  本文選題：玉米　切入點：胚性愈傷組織誘導(dǎo)率　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：玉米是全世界重要的糧食作物和能源作物,中國雖然是全世界玉米第二大生產(chǎn)國,但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和適應(yīng)性廣的優(yōu)質(zhì)玉米種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因育種是改良玉米種質(zhì)資源的重要途徑之一。玉米幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織是國際上廣泛采用的轉(zhuǎn)基因玉米受體類型,但由于生產(chǎn)上使用的玉米骨干自交系胚性愈傷組織誘導(dǎo)率普遍很低,而不能直接作為轉(zhuǎn)基因的受體材料。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因玉米育種流程要經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化、自交純合、回交轉(zhuǎn)育及雜交組培幾個環(huán)節(jié),一般從轉(zhuǎn)基因陽性材料自交純合到回交轉(zhuǎn)育獲得轉(zhuǎn)基因骨干自交系至少需要3-6年。玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)率因材料間基因型不同而差異較大,克隆控制胚性愈傷組織誘導(dǎo)率主效基因,解析玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)機理,創(chuàng)制更多的高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率玉米自交系有利于整個玉米轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域的快速發(fā)展。本研究選取301份遺傳豐富、胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力具有代表性的自交系組成的自然群體和高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系18-599R作為供試材料,結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析與Solexa數(shù)字基因表達譜等手段鑒定控制胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力、調(diào)控胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程的的基因。主要研究結(jié)果如下：1.以遺傳豐富的301份玉米自交系為材料,通過2014年和2015年兩個環(huán)境種植材料,授粉12天左右,選取幼胚大小在1.0-1.5mm的玉米材料挑取幼胚接種到含有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織,于挑胚后第7天統(tǒng)計每個材料的芽長、出芽率,15,20,25天調(diào)查胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。經(jīng)過統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)其中胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在40%～80%的材料有3個,30%～40%的材料有3個,20%～30%的材料有12個,10%～20%的材料有25個,0%～10%的材料有69個,0%的材料有188個。2.采用44243個最小等位基因頻率大于5%的高質(zhì)量SNP,結(jié)合群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系通過TASSEL軟件進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。兩個環(huán)境下共檢測到25個SNP與胚性愈傷組織顯著相關(guān)(P0.0001),其中僅有1個兩環(huán)境下共性SNP分布于玉米染色體bin 1.05,25個SNP共篩選到15個候選基因。根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能參與蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、線粒體構(gòu)成、電子傳遞、蛋白激酶活性等生理生化過程。另外對出芽率和芽長也進行全基因組關(guān)聯(lián)分析,兩個環(huán)境下共檢測到36個SNP與出芽率顯著相關(guān),其中共同檢測到與出芽率顯著相關(guān)的SNP 10個,28個SNP篩選到20個候選基因。根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能參與轉(zhuǎn)移酶活性,蛋白激酶活性,能量傳遞及異構(gòu)酶活性等功能。另外兩個環(huán)境下共檢測到53個SNP與芽長顯著相關(guān),共同檢測到與芽長顯著相關(guān)的SNP 6個,31個SNP篩選到31個候選基因,根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)調(diào)節(jié)因子活性,解旋酶活性,甲基轉(zhuǎn)移酶活性,氧化還原酶活性及水解酶活性等功能相關(guān)。3.以高誘導(dǎo)率自交系18-599為材料,將幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程劃分為胚膨大期、初級愈傷形成期、胚性愈傷組織形成期,利用數(shù)字表達譜(DGE)測序進行基因表達分析,結(jié)果表明未培養(yǎng)幼胚(CK)、幼胚膨大期(Stage Ⅰ)、初級愈傷組織形成期(Stage Ⅱ)、胚性愈傷組織形成期(Stage Ⅲ)分別有18951(14.55%),18359(56.42%),18140(15.83%),17870(15.5%)測序標簽可以比對到玉米基因組上；分別在3個培養(yǎng)階段檢測到4825、5119、5463個差異表達的基因；在3個階段存在超過5倍表達水平差異的基因中分別有199、230、250個基因是上調(diào)表達。而下調(diào)表達的基因比較稀少,在3個時期分別僅有52、94、63個基因。說明在玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程激活了大量基因的表達。4.COG分子功能注釋結(jié)果顯示,差異表達基因主要參與細胞構(gòu)成,信號轉(zhuǎn)導(dǎo),生理代謝等生物過程。KEGG Pathway分析結(jié)果表明Stage Ⅰ中差異表達基因主要富集在脂肪酸生物合成,細胞色素代謝外源性物質(zhì),α—麻酸新陳代謝途徑,Stage Ⅱ中差異表達基因主要富集在丙酮酸鹽代謝,植物激素的生物合成,脂肪酸的生物合成,Stage Ⅲ中差異表達基因主要富集在丙酮酸鹽代謝,糖酵解／糖原異生,苯丙素類生物合成。另外,植物激素信號傳導(dǎo)通路也是三個階段均檢測到的顯著通路。5.本研究通過關(guān)聯(lián)分析研究遺傳豐富的301份玉米自交系材料胚性愈傷組織率,篩選與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相關(guān)基因,同時通過數(shù)字基因表達譜研究高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率材料18-599R幼胚(對照),1-5天(Stage Ⅰ)、6-10天(Stage Ⅱ)、11～15天(Stage Ⅲ)材料,尋找幼胚在脫分化時期的差異表達基因。將通過關(guān)聯(lián)分析篩選得到的相關(guān)候選基因與差異表達基因進行對比,發(fā)現(xiàn)與三個性狀顯著關(guān)聯(lián)的相關(guān)候選基因有一部分也能在差異表達基因中找到。這些共性基因?qū)⑹呛罄m(xù)實驗關(guān)注的重點。6.我們對植物激素信號傳導(dǎo)通路中由MYB138介導(dǎo)的GA信號傳導(dǎo)通路進行了初步的驗證,發(fā)現(xiàn)外源GA3通過促進玉米幼胚不定芽的生長而抑制胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。ZmMYB138基因的擬南芥同源基因突變體atmyb65比野生型COL胚性愈傷組織誘導(dǎo)率下降了約20%,這部分葉片組織在誘導(dǎo)過程中產(chǎn)生變態(tài)芽而導(dǎo)致脫分化的失敗。
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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S513
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本文編號：1640378