本文選題：Alu元件　切入點(diǎn)：生物信息學(xué)分析　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:RNA對(duì)基因表達(dá)的影響主要包括抑制和活化基因兩個(gè)方面,這些工作在數(shù)十年前就引起了生物學(xué)家的重視,近年來(lái)在RNA活化基因(RNA激活)方面的資料在不斷積累。為了研究重復(fù)序列在活化基因中的作用,本研究中,使用不同組合的Alu重復(fù)序列,例如,兩個(gè)Alu基因位于同一質(zhì)�；虿煌|(zhì)粒組合,正義和反義Alu組合等,穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,觀(guān)察重復(fù)序列對(duì)EGFP報(bào)告基因表達(dá)的影響;使用生物信息學(xué)分析方法,比較人類(lèi)C組染色體著絲粒與其側(cè)翼DNA序列的RNA群結(jié)合強(qiáng)度,研究重復(fù)序列在RNA激活中的作用,并推理RNA激活的機(jī)理。方法:1報(bào)告質(zhì)粒和誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建2 PSI-rTetR質(zhì)粒的構(gòu)建3細(xì)胞轉(zhuǎn)染包括瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,詳細(xì)方法見(jiàn)正文。4熱休克處理5熒光顯微鏡觀(guān)察將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下觀(guān)察EGFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞,并進(jìn)行照相,計(jì)算EGFP表達(dá)量。6流式細(xì)胞儀檢測(cè)7序列資料和軟件從NCBI人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得序列資料,用本研究室編寫(xiě)的軟件(Gene-Analyser2.0)分析7-nt序列。8計(jì)算RNA群結(jié)合強(qiáng)度的方法RNA群結(jié)合強(qiáng)度的算法是基于互補(bǔ)的RNA和DNA越多,RNA和DNA結(jié)合的可能性越大的原理來(lái)進(jìn)行計(jì)算。具體的計(jì)算方法見(jiàn)正文。9 Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建Mini-C1-Alu-sense-sense(mini-Alu正正組合)等質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞用G418穩(wěn)定篩選,再轉(zhuǎn)染PSI-rTetR質(zhì)粒,用Puro穩(wěn)定篩選。得到G418和Puro雙抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞加入Dox和不加Dox進(jìn)行培養(yǎng),觀(guān)察EGFP表達(dá)量。10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間的比較使用均值±SD和t檢驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)只少三次,P0.05認(rèn)為兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞儀分析圖是至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表圖。結(jié)果:1質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定本研究構(gòu)建了五類(lèi)表達(dá)載體:1.1基于p EGFP-C1質(zhì)粒構(gòu)建的表達(dá)載體,為報(bào)告質(zhì)粒(Fig.1A,Table 1)。1.2基于pc DNA3.1構(gòu)建的表達(dá)載體,為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)的誘導(dǎo)質(zhì)粒(Fig.1B,Table 1)。1.3基于PSI構(gòu)建的表達(dá)載體,為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)的誘導(dǎo)質(zhì)粒(Fig.1C,Table1)。1.4 mini-C1報(bào)告質(zhì)粒(Fig.1D,Table 1)1.5 PSI-rTetR質(zhì)粒,用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(Fig.1E,Table 1)。2正義Alu和反義Alu組合后活化EGFP報(bào)告基因2.1正反組合的Alu重復(fù)序列對(duì)EGFP報(bào)告基因表達(dá)的影響Fig.2顯示正反組合的Alu序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)活化EGFP報(bào)告基因,然而將這些質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞時(shí),正反組合的Alu元件沒(méi)有活化EGFP基因表達(dá)的作用。當(dāng)兩個(gè)基因位于不同質(zhì)粒,不論瞬時(shí)還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,正反組合的Alu元件均沒(méi)有明顯活化基因作用(Table 4-7)。這些結(jié)果說(shuō)明,Alu元件活化基因必需正反組合,必需位于同一質(zhì)粒,且必需穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。2.2 Alu同源序列對(duì)EGFP報(bào)告基因表達(dá)的影響將C1-Alu-sense-Alu JB-sense(Alu正Alu JB正組合),C1-Alu-senseAlu JB-antisense(Alu正Alu JB反組合)(Table 1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,Fig.3顯示兩個(gè)質(zhì)粒的EGFP表達(dá)量沒(méi)有明顯差異,這兩個(gè)質(zhì)粒的EGFP基因表達(dá)量顯著低于A(yíng)lu正反組合的質(zhì)粒,說(shuō)明組合的正義Alu和反義Alu JB元件沒(méi)有顯著活化基因作用。3熱休克對(duì)EGFP報(bào)告基因表達(dá)的影響將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞后進(jìn)行熱休克處理,培養(yǎng)不同時(shí)間,觀(guān)察EGFP報(bào)告基因的表達(dá)。Fig.4顯示熱休克使Alu正Alu JB反組合質(zhì)粒的EGFP表達(dá)量顯著上升,在熱休克第2-4天達(dá)高峰,然后下降,在12天回到熱休克前的水平。熱休克對(duì)Alu正反組合質(zhì)粒中的EGFP基因表達(dá)也有顯著促進(jìn)作用,雖不如Alu正Alu JB反質(zhì)粒表現(xiàn)明顯,但是Alu正反組合的熱休克反應(yīng)可以維持更長(zhǎng)時(shí)間,到熱休克第20天,EGFP的表達(dá)仍然處于較高水平。將其它的對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后也進(jìn)行熱休克處理,熱休克4天后測(cè)定EGFP的表達(dá)量,Fig.5-Fig.6的結(jié)果說(shuō)明其它組合時(shí),熱休克均沒(méi)有使這些質(zhì)粒中的EGFP基因的表達(dá)顯著提高,而且與正反組合無(wú)關(guān)。4 Tet-on系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證了正反組合的Alu序列活化EGFP報(bào)告基因的觀(guān)點(diǎn)(詳細(xì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容見(jiàn)正文)。5 C組染色體著絲粒的RNA群結(jié)合強(qiáng)度低本研究利用生物信息學(xué)分析模擬RNA群與著絲粒序列及其側(cè)翼序列的結(jié)合強(qiáng)度。關(guān)于RNA群結(jié)合強(qiáng)度的具體計(jì)算方法見(jiàn)正文。Fig.8和Table 8的結(jié)果顯示著絲粒序列的RNA群的結(jié)合強(qiáng)度明顯低于側(cè)翼序列。結(jié)論:1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)錄的正反組合的Alu重復(fù)序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)能激活EGFP基因表達(dá)。熱休克使Alu正反,Alu正Alu JB反質(zhì)粒中的EGFP基因的表達(dá)顯著上升,但是Alu正反質(zhì)粒較Alu正Alu JB反質(zhì)粒能維持較長(zhǎng)時(shí)間。2生物信息學(xué)分析顯示C組染色體著絲粒的RNA群結(jié)合強(qiáng)度顯著低于其側(cè)翼序列。著絲粒的低RNA群結(jié)合強(qiáng)度的結(jié)果與提出的RNA激活基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q811.4

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本文編號(hào)：1636127