本文選題：基因輸送　切入點(diǎn)：陽(yáng)離子聚合物　出處：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：基因治療是指將外源治療基因輸送到靶細(xì)胞、以糾正或補(bǔ)償基因缺陷的一種遺傳水平上的治療方法。在過(guò)去的幾十年中,基因治療已被證實(shí)是一種有效的具有低副作用的癌癥治療新手段。非病毒基因輸送載體包括陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)體、樹(shù)枝狀大分子和多肽等,因其具有生物相容性良好、免疫原性低、易于化學(xué)修飾和制備方便等特點(diǎn)而成為各大科研機(jī)構(gòu)的研究熱點(diǎn)。然而與病毒載體相比,其臨床應(yīng)用受限于低效的基因轉(zhuǎn)染效率。陽(yáng)離子聚合物通過(guò)靜電相互作用中和負(fù)電性的DNA將其壓縮成納米顆粒,保護(hù)DNA免受降解,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞攝取,將DNA輸送到靶細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。迄今為止,已有大量的工作致力于通過(guò)平行合成的方式篩選出具有高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物。平行合成作為一種能夠通過(guò)調(diào)整單體結(jié)構(gòu)快速合成大量具有功能多樣性聚合物的手段已經(jīng)引起越來(lái)越多的關(guān)注。在高通量篩選后,可挑選出具有高轉(zhuǎn)染效率的聚合物,并且可以清晰地闡明聚合物結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)染效率之間的關(guān)系,這對(duì)于今后設(shè)計(jì)高效轉(zhuǎn)染效率的非病毒基因輸送載體具有重要意義。目前用于平行合成的方法往往局限于胺與丙烯酸酯或環(huán)氧反應(yīng),氨基硫醇與吖內(nèi)酯加成后的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)或passerini反應(yīng)。因此我們迫切需要設(shè)計(jì)新型的載體合成路線來(lái)制備用于基因輸送的一系列高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物。在此,本論文報(bào)道一種后修飾的方法來(lái)簡(jiǎn)易合成一系列酯酶響應(yīng)性的陽(yáng)離子聚合物基因輸送載體。我們通過(guò)巰烯點(diǎn)擊反應(yīng)將18種巰基胺側(cè)鏈單體鍵合于7種聚馬來(lái)酸烷基酯主鏈上,構(gòu)建出一個(gè)包含126種可降解陽(yáng)離子聚合物的基因輸送載體庫(kù),從而克服現(xiàn)存載體庫(kù)在功能和可擴(kuò)展性方面的限制,并證明不同結(jié)構(gòu)特征對(duì)基因輸送的影響。首先,使用熒光素酶編碼質(zhì)粒作為報(bào)告基因,借助半高通量篩選的方法,評(píng)價(jià)陽(yáng)離子聚合物的基因表達(dá)水平。在126種載體中,共有7種表現(xiàn)出高效的轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)具有良好的抗血清能力。其次,使用增強(qiáng)的綠色熒光蛋白編碼質(zhì)粒作為報(bào)告基因檢測(cè)表達(dá)細(xì)胞的百分比來(lái)評(píng)估7種聚合物的轉(zhuǎn)染效率。我們總結(jié)出聚合物結(jié)構(gòu)對(duì)DNA包裹能力,轉(zhuǎn)染效率,polyplex大小的影響。再次,構(gòu)建HeLa腹腔瘤模型,評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果最佳的載體G-1的抑瘤效果。G-1/pTRAIL納米復(fù)合物能夠成功將治療基因TRAIL輸送到腫瘤部位,表現(xiàn)出明顯高于PEI25k/pTRAIL的抑瘤效率,同時(shí)沒(méi)有毒副作用。
[Abstract]:Gene therapy is a genetic treatment that transports foreign therapeutic genes to target cells to correct or compensate for genetic defects. Gene therapy has been proved to be an effective new method for cancer treatment with low side effects. Non-viral gene delivery vectors include cationic polymers, liposomes, dendritic macromolecules and polypeptides because of their good biocompatibility. Because of its low immunogenicity, easy chemical modification and easy preparation, it has become a hot research topic in various scientific research institutions. However, compared with viral vectors, Its clinical application is limited by the low efficiency of gene transfection. Cationic polymers compress it into nanoparticles by electrostatic interaction and negatively charged DNA to protect DNA from degradation and promote cell uptake. Transfection of DNA into target cells. So far, A great deal of work has been done to screen cationic polymers with high transfection efficiency by parallel synthesis. As a kind of cationic polymer with high transfection efficiency, parallel synthesis can rapidly synthesize a large number of functional diversity polymerization by adjusting monomer structure. Material means have attracted more and more attention. After high-throughput screening, Polymers with high transfection efficiency can be selected and the relationship between polymer structure and transfection efficiency can be clearly clarified. This is of great significance for the future design of non-viral gene delivery vectors with high transfection efficiency. The current methods for parallel synthesis are often limited to the reaction of amine with acrylate or epoxide. The ring-opening polymerization or passerini reaction after addition of aminothiol with acridine. Therefore, we urgently need to design a novel carrier synthesis route to prepare a series of high transfection efficiency cationic polymers for gene transport. A series of esterase responsive cationic polymer gene delivery vectors were synthesized by a post-modification method. Eighteen mercapto amine side chain monomers were bonded to 7 polyalkyl maleate main chains by mercapto click reaction. A gene transfer vector library containing 126 biodegradable cationic polymers was constructed to overcome the functional and extensible limitations of the existing vector library and to prove the influence of different structural characteristics on gene delivery. Luciferase encoding plasmids were used as reporter genes to evaluate the gene expression level of cationic polymers by semi-high-throughput screening. Seven of 126 vectors showed high transfection efficiency. At the same time have good antiserum ability. Secondly, The transfection efficiency of seven kinds of polymers was evaluated by using enhanced green fluorescent protein coding plasmid as a percentage of reporter gene to detect expression cells. We summarized the effect of polymer structure on DNA encapsulation ability, transfection efficiency and the size of polyplex. HeLa peritoneal tumor model was constructed to evaluate the anti-tumor effect of the vector G-1. G-1 / pTRAIL nanocomplex could successfully transport the therapeutic gene TRAIL to the tumor site, which was significantly higher than that of PEI25k/pTRAIL, and had no toxic and side effects.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R450

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本文編號(hào)：1632467