本文選題：微小RNA　切入點：EGFR　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：前言肺癌的發(fā)病率與死亡率在全球范圍內始終居于諸多惡性腫瘤的前位,嚴重威脅人類生命與健康[1]。雖然近年來肺癌領域有諸多進展,其整體5年生存率仍較低[2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%~85%,主要分為腺癌、鱗癌及大細胞癌。絕大多數(shù)NSCLC患者確診時已為中晚期,化療、分子靶向治療、放療及免疫治療等是其主要選擇,這其中驅動基因指導下的個體化分子靶向“精準治療”可謂引領了NSCLC治療的新時代。NSCLC目前最主要的“可藥化”驅動基因當屬表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因,約占NSCLC總驅動基因的44%[3]。EGFR敏感突變在亞裔人群中陽性率約30%~40%,高加索人群中為10%~20%[4]。EGFR基因第19號外顯子缺失突變(EGFR mutation of exon 19 deletions,EGFR 19DEL)以及第21號外顯子L858R點突變(EGFR mutation of exon 21 L858R substitutions,EGFR L858R)是最主要的兩種敏感突變類型,占到EGFR總突變類型的85%~90%[5]。目前各大指南推薦的EGFR基因突變檢測系基于腫瘤組織或細胞學標本進行,被認定為“金標準”,然而在臨床實踐中,部分患者的腫瘤組織難以獲取,并且二次活檢進行EGFR基因突變的動態(tài)再分型較難實現(xiàn)。這使得基于血液以及體液等均質樣本的“液態(tài)活檢”成為熱點。目前研究最為成熟的為血漿游離腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)檢測EGFR敏感突變的技術,然而,與金標準相比,ct DNA檢測雖有較高的特異性(達95%~100%),但敏感性僅65%~75%左右[6]。改善提高現(xiàn)有技術的靈敏度或研發(fā)新的EGFR敏感突變檢測技術,另外如有新的潛在診斷標志物與其聯(lián)合,有望進一步提高其臨床應用價值。微小RNA(micro RNA,miRNA)屬非編碼RNA,其表達失控可引起包括其調控的靶基因以及其相關的重要信號通路組成的調控網絡發(fā)生異常,促進了腫瘤的發(fā)生或發(fā)展[7,8]。研究顯示目前發(fā)現(xiàn)的人類miRNA分子中多數(shù)能夠在人類體液中檢出,部分指標在惡性腫瘤患者中有不同程度的表達失調[9]。由于在循環(huán)中的穩(wěn)定性以及良好的敏感性與特異性,循環(huán)miRNA有望作為一種新的腫瘤標志物應用于多種惡性腫瘤的診療。目前亦有少數(shù)研究報道在EGFR敏感突變型及EGFR野生型患者的血液樣本中檢測到了有顯著差異的miRNA,這些研究多為小樣本的探索性研究,未能針對EGFR主要不同突變類型進行完整的對照分析,且各研究結果亦有較大的差別[10-12]。目前為止缺乏其他針對NSCLC患者血漿樣本循環(huán)miRNA作為EGFR敏感突變狀態(tài)潛在標志物的更為深入的研究。本研究首先從在本科室確診的首診NSCLC患者中隨機選取部分病例,回顧性分析現(xiàn)實情況中收治NSCLC患者的EGFR基因突變檢測狀況,明確真實世界中能順利完成EGFR基因突變檢測并接受EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)一線治療的患者比率;同時系統(tǒng)地收集不同臨床特征人群的血漿樣本,嘗試尋找在EGFR敏感突變及EGFR野生型患者血漿中有差異表達的miRNA并首次探索性地分析了循環(huán)miRNA隨EGFR-TKI治療過程的動態(tài)變化;而且本研究建立起適合本研究的檢測血漿miRNA的q RT-PCR的實驗方法并篩選出適合的內參基因;這為后續(xù)擴大樣本及進一步深入研究奠定了基礎。第一部分:單中心首診NSCLC患者EGFR基因突變檢測情況回顧目的:總結了解現(xiàn)實情況中收治EGFR基因突變檢測狀況及突變檢測結果。方法:回顧性分析2013年04月至2016年04月期間就診于我科627例首診的NSCLC患者的臨床病理特征,重點分析其EGFR基因突變檢測情況,對EGFR敏感突變的患者接受EGFR-TKI治療的無進展生存期(progression-free survival,PFS)進行分析總結。結果:所有納入NSCLC患者(n=627)的中位年齡為58歲,其中56.0%(315/627)為男性,48.6%(305/627)患者無吸煙史,82.6%(518/627)患者臨床分期為IV期,84.4%(529/627)患者病理類型為腺癌。75.4%(473/627)的患者接受了EGFR基因突變檢測,患者從就診至取得病理診斷以及EGFR突變分型報告的中位診斷時間為12天(5-27天),送檢樣本類型以組織標本為主,占63.8%(302/473),其次為血漿樣本,占23.0%(109/473),胸水樣本占5.5%(26/473),其余36例患者同時送檢了組織及血漿樣本。血液樣本送檢的比例隨年份的增加而呈升高趨勢,2015年04月至2016年04月期間,送檢的血液樣本占40.7%。在接受檢測的NSCLC患者中,EGFR敏感突變陽性率為35.7%(169/473),其中94例(55.6%)為EGFR 19DEL,69例(40.8%)為EGFR L858R,余6例為少見突變。EGFR MU(+)與EGFR WT組患者相比,其年齡、性別、吸煙史及病理類型分布均有顯著差別。EGFR敏感突變的169例患者中有133例一線接受了EGFR-TKI治療,客觀緩解率(objective response rate,ORR)73.7%,中位PFS 10.0個月(95%CI 8.75-11.25)。其中EGFR 19DEL組患者中位PFS要優(yōu)于EGFR L858R組患者(11.0個月vs 8.0個月,HR=0.57,p=0.011)。結論:我科臨床實踐工作中有較高比例的首診NSCLC患者接受了EGFR分子分型檢測。血液標本送檢的比例呈逐年升高趨勢。EGFR敏感突變的NSCLC患者一線接受EGFR-TKI有較好的療效,且EGFR 19DEL患者PFS優(yōu)于EGFR L858R患者。第二部分:EGFR敏感突變與EGFR野生型NSCLC患者血漿差異性表達miRNA的初步篩選目的:通過miRNA microarray芯片初步尋找出在EGFR敏感突變[EGFR MU(+)]及EGFR野生型(EGFR WT)患者血漿樣本中有差異表達的miRNA。方法:收集9例NSCLC患者(3例EGFR 19DEL、3例EGFR L858R、3例EGFR WT)、4例健康受試者(healthy cohorts,HCs)血漿樣本。運用Agilent Human miRNA Microarray(V21.0)芯片對樣本進行獨立的全基因組miRNA表達分析。采用Gene Spring GX軟件進行數(shù)據歸一化處理。采用T-test unpair方法計算得到p值以比較樣本間miRNA差異表達;運用聚類分析方法(Hierarchical clustering)進行miRNA表達差異的分類。結果:所有NSCLC與HCs血漿樣本中有76個呈顯著性差異的miRNA。EGFR MU(+)與EGFR WT患者相比,有6個miRNA顯著上調、4個顯著下調。具體到EGFR敏感突變的不同類型,EGFR 19DEL較EGFR WT相比,有14個miRNA顯著上調、7個顯著下調;而EGFR L858R較EGFR WT相比僅有2個顯著上調以及3個顯著下調的miRNA;EGFR 19DEL與EGFR L858R相比有22個呈顯著差異表達的miRNA。結論:通過miRNA microarray芯片檢測,NSCLC與HCs人群之間以及不同EGFR敏感突變NSCLC患者之間可以在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)有顯著差異的miRNA,可從中進行初步篩選并后續(xù)進行分析驗證。第三部分:反轉錄實時熒光定量PCR(q RT-PCR)方法檢測循環(huán)miRNA的內參篩選目的:篩選出最適合本實驗體系的以q RT-PCR方法檢測受試者循環(huán)miRNA的內參基因。方法:共收集34例不同人群受試者血漿樣本:HCs 8例、肺良性疾病者8例、肺腺癌10例、肺鱗癌4例、肺小細胞癌4例。以q RT-PCR方法檢測樣本中12個備選內參基因的表達水平。以各樣本中備選內參基因的原始Ct值與Ct均值的差值在EXCEL軟件繪制散點圖,觀察各樣本中待篩內參基因的穩(wěn)定性;之后采用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper軟件對備選內參基因在不同樣本中的表達穩(wěn)定性進行分析。結果:散點圖顯示以5SrRNA、18SrRNA以及RNU43變異幅度最小。Best Keeper軟件分析顯示CP值最低的為5Sr RNA及18Sr RNA,分別為1.806及1.821;Norm Finder軟件分析結果顯示5Sr RNA的穩(wěn)定性值(Stability value)為最低(0.303),其次為RNU43(0.631);ge Norm軟件分析結果顯示5Sr RNA和RNU38B的M值為最低(1.281),結合配對變異分析Vn/n+1結果圖推薦5Sr RNA和RNU38B的組合作為內參基因。結論:實驗確定在本體系中以5SrRNA作為qRT-PCR方法檢測NSCLC患者循環(huán)miRNA表達水平的內參基因最為適宜。第四部分:EGFR MU(+)與EGFR WT的NSCLC患者血漿差異性表達miRNA的分析與驗證目的:以q RT-PCR方法檢測目的miRNA在擴大樣本的各組患者血漿中的表達情況,篩選出可能與EGFR敏感突變相關的特異性循環(huán)miRNA。方法:結合芯片結果以及已發(fā)表文獻,篩選出備選的目的差異miRNA。通過在20例NSCLC(12例EGFR 19DEL及8例EGFR WT)及8例HCs血漿樣本中的預實驗,初步篩選出有差異表達的miRNA后,對153例NSCLC患者(EGFR19DEL 64例,EGFR L858R 36例,EGFR WT 53例)進行擴大樣本分析。不同組別之間miRNA的差異表達比較用非配對T檢驗或單因素方差分析進行分析。卡方檢驗用來分析定性資料。采用軟件進行受試者工作特征曲線(Receiving Operating Characteristics Curve,ROC)及Logistic回歸分析(Logistic Regression)評估目的miRNA區(qū)分不同EGFR基因突變類型的診斷價值。采用Target Scan、Pic Tar、miRDB以及miRanda軟件對得到的目的miRNA進行靶基因預測并通過KEGG pathway預測其相關的信號通路。結果:預實驗中對10個待篩的目的miRNA進行qRT-PCR檢測,結果顯示miR-107、miR-122、miR-125a-5p及miR-195可作為目的miRNA進行后續(xù)分析。擴大樣本后分析結果顯示,miR-107可較好的區(qū)分EGFR 19DEL與EGFR WT(AUC=0.72,敏感性64.7%,特異性76.6%,cutoff=0.097)以及EGFR L858R與EGFR WT(AUC=0.77,敏感性64.2%,特異性80.6%,cutoff=0.153);與EGFR WT組相比,miR-122診斷EGFR L858R的敏感性和特異性分別為73.6%及63.9%(cutoff=0.124),AUC=0.75;miR-195作為潛在標志物診斷EGFR 19DEL的敏感性和特異性分別為71.8%及69.1%(cutoff=0.876),AUC=0.75。miR-107分別與miR-122及miR-195組成的組合標志物其各診斷參數(shù)優(yōu)于各自單個指標。多因素分析結果顯示,吸煙狀態(tài)以及miR-107的表達與EGFR敏感突變狀態(tài)密切相關。miR-107可能通過靶向于CACNA2D1、NF1、BDNF基因而參與到MAPK信號通路;miR-195可能通過靶基因HMGA2及RECK而參與MAPK信號通路。結論:NSCLC患者血漿中循環(huán)miR-107、miR-122及miR-195的表達水平可能與EGFR19DEL或EGFR L858R突變亞型有顯著相關性,有望作為潛在的標志物來輔助區(qū)分NSCLC患者EGFR敏感突變與野生型的基因分型。第五部分:目的循環(huán)miRNA在EGFR-TKI治療前后動態(tài)變化的初步分析目的:初步探索EGFR 19DEL的NSCLC患者在接受EGFR-TKI治療前、治療過程中以及進展后的循環(huán)miRNA的動態(tài)變化。方法:收集36例EGFR 19DEL敏感突變并采集到EGFR-TKI治療前與治療中動態(tài)配對血樣的患者血漿標本(其中有12例患者同時采集到疾病進展后的血樣),對上述血樣進行q RT-PCR方法檢測其miR-107以及miR-195的表達情況。以EXCEL圖表功能直觀分析EGFR-TKI治療前、治療中以及進展后ΔCt值的動態(tài)變化。不同組別之間miRNA的ΔCt值變化情況比較用非配對t檢驗或單因素方差分析方法進行分析。結果:近期療效為緩解(CR+PR)患者較疾病穩(wěn)定(SD)患者相比,miR-107以及miR-195在治療后有更為顯著的下降趨勢(p0.05);而PFS8.0個月以及PFS≤8.0個月的患者其兩個目的miRNA的變化幅度未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。無論是近期療效是緩解、穩(wěn)定還是進展的患者,其血漿miR-107以及miR-195在疾病進展后都有回到治療前水平的趨勢。結論:循環(huán)miRNA的表達水平會隨EGFR-TKI治療進程發(fā)生動態(tài)變化,且近期療效不同的患者可能表現(xiàn)出不同的變化趨勢。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1628244