本文選題：耐藥基因　切入點：納米氧化鋁　出處：《山東師范大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：納米材料的污染和耐藥基因的擴散正日益成為全球公共健康的威脅。當(dāng)納米材料和耐藥基因(antibiotic resistance genes,ARGs)相遇,它們會如何相互作用?納米材料是否能夠協(xié)助死亡菌體釋放的耐藥基因進入活的菌體細(xì)胞從而引起耐藥基因的擴散?本項目采用抗性篩選法研究不同尺寸、不同濃度氧化物對不同濃度、不同種類耐藥基因水平轉(zhuǎn)移入不同菌株細(xì)胞的影響。結(jié)果表明納米氧化物顆粒,特別是納米氧化鋁(nano-Al2O3)能夠促進耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。與大腸桿菌K12相比,大腸桿菌HB101是一種易于耐藥基因轉(zhuǎn)化的菌株,能夠攝入更多的耐藥質(zhì)粒,所以我們推斷轉(zhuǎn)化是納米顆粒促進耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的方式之一。同時,這種促轉(zhuǎn)移作用與耐藥質(zhì)粒和納米顆粒的結(jié)合有關(guān),所以納米顆�？赡茌d帶耐藥質(zhì)粒進入菌體細(xì)胞,然后緩慢釋放。本文證明納米氧化鋁能夠顯著促進質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)化,包括進入革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(質(zhì)粒需修飾),而尺寸大的氧化鋁顆粒無此作用。在適宜條件下菌體細(xì)胞與納米氧化鋁相互作用,每100 ng耐藥質(zhì)粒能夠獲得7.4×106個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子,或者2.9×105個金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化子。納米顆粒的濃度、質(zhì)粒濃度、菌體細(xì)胞數(shù)目、材料與菌體細(xì)胞的作用時間、渦旋混勻時間等因素都會影響轉(zhuǎn)化效率。我們進一步探討了現(xiàn)象背后的機制。通過原位雜交和掃描電鏡觀察,結(jié)果表明納米氧化鋁可損傷細(xì)菌細(xì)胞膜,致其產(chǎn)生孔洞,耐藥基因可通過孔洞進入細(xì)胞。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)檢測實驗、轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果表明內(nèi)源性活性氧自由基可能損傷細(xì)胞膜,SOS(Save Our Ship,SOS)應(yīng)答促進了耐藥基因的轉(zhuǎn)化�？股氐臑E用使環(huán)境中耐藥基因和耐藥菌大規(guī)模爆發(fā),帶來了人和動物的公共健康問題。我們的前期研究結(jié)果表明在我國主要河流中不僅能檢測到天然的耐藥基因,也發(fā)現(xiàn)了人工合成的耐藥基因。研究表明:在水中納米顆粒能夠顯著促進質(zhì)粒RP4、RK2、p CF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移。本研究證實納米顆粒通過結(jié)合和致密壓縮耐藥基因從而保護其抵抗核酸酶Hind III、Hinc II、Sal I、Sty I、Nco I、Nde I和DNase I的降解,并作為載體參與耐藥基因的轉(zhuǎn)移。這種結(jié)合與納米顆粒的濃度、兩者作用時間、離子種類和濃度有關(guān)�；诩t外光譜、紫外光譜和原子力顯微鏡分析,我們推測納米氧化鋁幫助耐藥基因抗酶解的機制為:納米顆粒導(dǎo)致的致密壓縮改變了耐藥基因分子的結(jié)構(gòu)。在緊密結(jié)合在一起抗酶解的同時,氧化鋁納米顆粒能夠載帶耐藥質(zhì)粒進入菌體細(xì)胞。本研究首次發(fā)現(xiàn)納米氧化鋁顆粒的這種載帶功能,我們稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)�；蛐酒D(zhuǎn)錄組分析和實時定量PCR探討了其分子機制。在合適條件下菌體細(xì)胞與nano-Al2O3-p BR322復(fù)合物相互作用,每100 ng耐藥質(zhì)粒能夠獲得3.5×104個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。與納米氧化鋁結(jié)合的耐藥質(zhì)粒越多,耐藥基因的轉(zhuǎn)移率就越高。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的分子機制可能為:納米氧化鋁載帶耐藥質(zhì)�？缒まD(zhuǎn)運時,引起細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng),抑制關(guān)鍵的代謝基因rdg B、gly A、pgm、acc C、deo D、pgi、asp C等的表達(dá),為細(xì)胞節(jié)省能量和物質(zhì)。上調(diào)pol B、rec N、ruv A、uvr B、uvr D、din G等SOS應(yīng)答基因,促進耐藥基因的復(fù)制與表達(dá)。氧化物特別是氧化鋁納米顆粒能夠通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)方式促進耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,其機制可能為氧化損傷。采用數(shù)學(xué)模型分析了不同方式在不同時間點的比重變化,結(jié)果表明隨著納米顆粒與細(xì)胞作用時間的延長,轉(zhuǎn)化所占的比重越來越大。結(jié)論:納米顆粒在適當(dāng)條件下能夠促進耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,但其機制有待進一步研究。我們的結(jié)果也暗示:環(huán)境中納米材料可能在幫助細(xì)菌獲得耐藥性,其所帶來的環(huán)境和健康風(fēng)險應(yīng)當(dāng)引起人們的注意。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TB383.1;R378

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