本文選題：分子標(biāo)記物　切入點(diǎn)：循環(huán)游離DNA　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,每年累及超過(guò)60萬(wàn)人的生命,成為最為常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)死亡病因之一[1,2]。HCC的致病因素復(fù)雜,常見(jiàn)的HCC高危因素有慢性肝炎病毒感染,包括HBV和HCV的感染,長(zhǎng)期大量攝入酒精及暴露于致癌物質(zhì)如黃曲霉素B等[3]。近些年,肥胖和糖尿病引起的非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)HCC的發(fā)病率有上升趨勢(shì)[4]。HCC發(fā)病隱匿、臨床癥狀不典型,早期診斷率低,目前對(duì)于早期HCC主要的治療方式是手術(shù)切除,輔以射頻消融、化療栓塞等治療,但患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高,有50%-70%的患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[5,6]。中晚期HCC患者治療選擇非常有限;肝移植是治療HCC的有效方式,但由于供肝短缺,受益患者范圍有限;索拉非尼能夠使晚期肝癌患者受益,但是有效率較低。因此近些年的研究顯示,手術(shù)治療聯(lián)合免疫治療、分子靶向治療的HCC綜合治療模式是未來(lái)HCC精準(zhǔn)治療的發(fā)展方向[7,8]。由于HCC發(fā)病因素復(fù)雜,形成了具有高度異質(zhì)性的腫瘤微環(huán)境,表現(xiàn)在不同患者間腫瘤存在差異、同一患者不同病灶及同一腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)部細(xì)胞存在異質(zhì)性[9],因此需要制定針對(duì)HCC患者個(gè)體腫瘤分子病理分型的個(gè)體化治療方案,可以避免盲目用藥和不必要的藥物毒副作用。腫瘤個(gè)體化治療需要在治療前制定針對(duì)性的治療方案,還需要在治療過(guò)程中對(duì)腫瘤患者進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。目前臨床上常用的HCC監(jiān)測(cè)方式包括血清AFP測(cè)定和超聲檢查,但其對(duì)早期HCC的診斷敏感性只有40%-50%,CT、MRI檢查在臨床上可選,但由于檢查費(fèi)用較高、本身輻射作用強(qiáng)及患者依存性較差而不易反復(fù)多次進(jìn)行[6,10]。此外,傳統(tǒng)HCC監(jiān)測(cè)方式不能反映腫瘤內(nèi)部和腫瘤之間的異質(zhì)性,因此迫切需要研發(fā)出用于肝癌早期診斷和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。目的:評(píng)估基于第二代測(cè)序技術(shù)的肝癌相關(guān)基因變異檢測(cè)是否可以用于分析肝癌的分子分型,觀察肝癌細(xì)胞系腫瘤相關(guān)基因的變異,是否可用于肝癌的伴隨分子診斷手段。材料和方法:本研究分為兩個(gè)部分,第一部分,利用基于第二代測(cè)序技術(shù)的目標(biāo)基因靶向測(cè)序技術(shù),對(duì)7個(gè)常見(jiàn)hcc細(xì)胞系dna325個(gè)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行捕獲測(cè)序。分析dna中的腫瘤相關(guān)突變基因及突變負(fù)荷率,比對(duì)出差異基因,以及差異基因的突變趨勢(shì)。第二部分選擇收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)肝膽胰腺外科29例外科手術(shù)治療的hcc患者標(biāo)本,包括術(shù)前1天血漿標(biāo)本、外周血白細(xì)胞(pbmc)及手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁組織。選用覆蓋第一部分的50個(gè)常見(jiàn)腫瘤原癌基因和抑癌基因的擴(kuò)增子試劑盒,基于illuminahiseqxten測(cè)序平臺(tái),對(duì)血漿cfdna、腫瘤組織dna及癌旁組織dna進(jìn)行靶向擴(kuò)增子測(cè)序,納入等位基因突變頻率(mutantallelefrequency,maf)高于1%的基因位點(diǎn)。比較hcc患者術(shù)前血漿cfdna、腫瘤組織dna及癌旁組織dna的高頻突變基因的變異,pbmc來(lái)源的基因組dna作為對(duì)照用于排除生殖細(xì)胞變異。同時(shí)對(duì)血漿cfdna中基因突變與患者腫瘤負(fù)荷進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:本研究的第一部分,本研究采用基于腫瘤基因捕獲的高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)7種肝癌細(xì)胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,mhcc97h,mhcc97l,hepg2,hepg2.2.15)的體細(xì)胞突變。采用包含325個(gè)腫瘤相關(guān)基因panel的羅氏nimblegen定制序列捕獲系統(tǒng),對(duì)細(xì)胞株樣本進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的捕獲和雙端測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示目標(biāo)區(qū)域平均覆蓋率達(dá)99.7%,平均測(cè)序深度約1000×,共檢出100個(gè)基因發(fā)生突變,包括344個(gè)非同義突變。其中有38個(gè)與癌癥密切相關(guān)的突變基因富集于5條致癌信號(hào)通路:染色質(zhì)重塑,notch,mapk,p53和wnt/β-catenin通路。與hcc患者體細(xì)胞突變的前期報(bào)道比較,肝癌細(xì)胞株中染色質(zhì)重塑和notch信號(hào)通路中基因突變負(fù)荷更高。四種來(lái)自不同hcc患者建系的肝癌細(xì)胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,hepg2)有不同突變模式,但同一個(gè)克隆來(lái)源的肝癌細(xì)胞株突變呈現(xiàn)較大相似性。本研究的第二部分前瞻性的觀察了靶向測(cè)序技術(shù)可檢測(cè)到腫瘤相關(guān)高頻突變基因。28例患者腫瘤組織中有27例(96%)樣本檢測(cè)到至少2個(gè)基因突變(中位突變基因數(shù)6,2-18不等),1例患者腫瘤組織未測(cè)到任何基因的突變,腫瘤組織中檢測(cè)到的35個(gè)突變基因中,以tp53、atm、alk的突變頻率最高,分別是50%(14/28)、39%(11/28)和39%(11/28);全部29例(100%)患者血漿cfdna中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)基因突變(中位突變基因數(shù)27,6-47不等),其中包括大量低頻突變基因。比較同一患者腫瘤組織dna和術(shù)前血漿cfdna的基因突變,發(fā)現(xiàn)28例有配對(duì)樣本的患者中,21例(21/28,75%)患者血漿cfdna與腫瘤組織dna中檢測(cè)到至少一個(gè)完全一致的基因突變,其中以tp53、pdgfra、kit、及npm1突變頻率最高,分別是33%(7/21)、23.8%(5/21)、19%(4/21)及19%(4/21);7例(7/28,25%)患者血漿cfdna與腫瘤組織dna中未檢測(cè)到一致的基因突變,其中1例患者腫瘤組織dna中未檢測(cè)到任何基因的突變,其血漿cfdna中檢測(cè)到包括cdkn2a、egfr等基因在內(nèi)的低頻突變。此外,28例有配對(duì)樣本的hcc患者中,17例(17/28,61%)患者癌旁組織dna中檢測(cè)到與腫瘤組織dna中完全一致的基因突變,其中14例(14/17,82%)患者腫瘤組織dna與癌旁組織dna一致的突變基因在血漿cfdna中可檢測(cè)到,其中高頻突變基因包括pdgfra、kit及npm1等基因。比較afp水平與血漿cfdna突變檢測(cè)的結(jié)果顯示,29例患者中有14例(48.3%)患者afp陽(yáng)性(20ng/ml),24例(82.7%)患者血漿cfdna中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)基因突變及15例afp陰性患者中有13例(86.7%)患者血漿cfdna中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)基因突變;并且血漿cfdna和腫瘤組織dna有一致突變基因的患者血清afp水平顯著高于非一致突變組患者,兩組患者afp水平中位值分別是144ng/ml和2.5ng/ml(p=0.016)。本研究中,血漿cfdna濃度與患者臨床病理特征無(wú)直接相關(guān)性,而腫瘤直徑5cm組患者中tp53、ctnnb1、pik3ca及cdkn2a基因的maf水平高于腫瘤直徑5cm組患者,且腫瘤多發(fā)或伴隨轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中tp53、ret、fgfr3及apc基因的maf水平較腫瘤單發(fā)組患者。結(jié)論:1.本研究通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞株進(jìn)行腫瘤相關(guān)基因捕獲測(cè)序,明確了實(shí)驗(yàn)室常用肝癌細(xì)胞模型的體細(xì)胞突變,也初步揭示相同和不同克隆來(lái)源的肝癌細(xì)胞株的突變模式。2.HCC患者血漿cfDNA可能替代腫瘤組織活檢,作為HCC突變基因篩查的分子標(biāo)志物;本研究中HCC患者血漿cfDNA中基因突變的MAF水平與腫瘤負(fù)荷顯著相關(guān),提示血漿cfDNA可能成為HCC輔助診斷的分子標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1622456