本文選題：鸚鵡熱衣原體　切入點：PmpD-N蛋白　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鸚鵡熱衣原體是專性胞內(nèi)革蘭氏陰性菌,禽感染后能夠引起禽衣原體病,人感染后通常表現(xiàn)為流感樣癥狀。衣原體免疫需要高效的細(xì)胞免疫和體液免疫,商品化的鸚鵡熱衣原體亞單位疫苗不能提供良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答。火雞皰疹病毒(HVT)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體液免疫,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于開發(fā)家禽的多價活載體疫苗。本研究首先建立了檢測鸚鵡熱衣原體抗體的間接ELISA方法和檢測HVT病毒含量的實時熒光定量PCR方法,之后通過利用細(xì)菌人工染色體(BAC)技術(shù)構(gòu)建表達(dá)pmpD-N基因的重組HVT活載體疫苗,并將該疫苗免疫雞后評價其對馬立克病毒和鸚鵡熱衣原體的保護(hù)效果。PmpD-N ELISA方法的建立及初步應(yīng)用：采用純化的鸚鵡熱衣原體PmpD-N重組蛋白為包被抗原,優(yōu)化反應(yīng)條件和檢測限,建立檢測抗體的間接ELISA方法。結(jié)果表明該方法敏感性為97.9%,特異性為100%,重復(fù)性好,與MOMP ELISA符合率為98.1%。該方法可以用于臨床血清樣品的檢測,同時為本研究后續(xù)疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。火雞皰疹病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立：以HVT的sorfl區(qū)基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,建立檢測HVT的實時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閩值(Ct)與模板拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系(r2=0.99),熔解曲線分析顯示其PCR擴(kuò)增具有良好的特異性,能檢測到的最低模板濃度為7×10’拷貝/μL,對不同濃度的質(zhì)粒重復(fù)檢測得出的Ct值的變異系數(shù)最高僅為1.44%,并可以鑒別診斷HVT和CV1988。該方法可用于HVT病毒含量測定,同時為本研究后續(xù)檢測HVT的體內(nèi)外增殖情況提供了有效手段。pmpD-N基因重組HVT的構(gòu)建：改造HVT感染性BAC克隆,使其分別表達(dá)帶有CMV和EF-1 α啟動子的pmpD-N基因,拯救重組BAC,體外鑒定重組病毒的相關(guān)特性。結(jié)果成功獲得HVT重組病毒(rHVT-CMV-pmpD和rHVT-EF-1 α-pmpD)。Western-blotting和IFA分析表明二者均表達(dá)了PmpD-N蛋白,而且PmpD-N蛋白在rHVT-CMV-pmpD中的表達(dá)量是rHVT-EF-1α-pmpD的四倍。Confocal分析顯示PmpD-N蛋白分布在細(xì)胞的胞核、胞漿和細(xì)胞表面。rHVT-CMV-pmpD的復(fù)制特性和野生型HVT一致,在體外進(jìn)行連續(xù)傳代到20代時仍能穩(wěn)定表達(dá)PmpD-N蛋白,能夠激活巨噬細(xì)胞。pmpD-N基因重組HVT免疫效力評價：采用8000PFU的rHVT-CMV-pmpD免疫1日齡SPF雞,免疫后第8天腹腔攻毒馬立克病毒強(qiáng)毒RB-1B,第36天喉頭接種鸚鵡熱衣原體CB7株,評價免疫保護(hù)效果。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,rHVT-CMV-pmpD免疫雞后在體內(nèi)的增殖水平與野生型HVT無顯著性差異。免疫后產(chǎn)生了針對PmpD-N的特異性抗體以及高水平淋巴刺激指數(shù),CD4+細(xì)胞比例呈現(xiàn)顯著性升高,誘導(dǎo)了高水平的Th1細(xì)胞免疫。攻毒超強(qiáng)毒馬立克病毒后,免疫組雞保護(hù)率100%,對照組雞全部發(fā)病。攻毒鸚鵡熱衣原體后,免疫組的病變指數(shù)顯著性降低,喉頭拭子排菌量和肺臟的細(xì)菌載量顯著性下降。本研究構(gòu)建的重組HVT活載體疫苗可以提供良好的免疫保護(hù)效果。綜上所述,本研究建立的PmpD-N ELISA方法可以檢測鸚鵡熱衣原體的早期感染；建立的實時熒光定量PCR檢測方法可以測定HVT的病毒含量；利用BAC技術(shù)成功構(gòu)建表達(dá)PmpD-N的重組HVT活載體疫苗可以作為預(yù)防馬立克病毒和鸚鵡熱衣原體的候選疫苗。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.67
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本文編號：1622037