本文選題：AP2/ERF　切入點(diǎn)：丹參　出處：《陜西師范大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：植物AP2/ERF家族是一個龐大的植物轉(zhuǎn)錄因子超家族,廣泛存在于植物中。該家族蛋白均含有1或2個由60-70個氨基酸組成的高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域,廣泛參與植物生長發(fā)育、衰老、抗性、代謝等眾多生物學(xué)過程。丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生草本藥用植物。具有抗血栓、消炎、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用,在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病的治療。丹參作為一種重要的藥用模式植物,目前關(guān)于其轉(zhuǎn)錄因子的研究較少,眾多轉(zhuǎn)錄因子,尤其是ERF基因家族成員的功能尚不明了。在實(shí)驗(yàn)室數(shù)字表達(dá)譜篩選的基礎(chǔ)上,本研究克隆并分析了一條ERF轉(zhuǎn)錄因子基因SmERF1 (unigene46389),通過超表達(dá)該基因,對其在丹參生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、次生代謝調(diào)控等方面的生物學(xué)功能做了初步研究。本研究的主要內(nèi)容與結(jié)果如下：1.依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基因序列(unigene46389),通過PCR擴(kuò)增從丹參中克隆得到了SmERF1基因,該基因含有一個長度為549 bp開放閱讀框,編碼182個氨基酸,含有一個由63個氨基酸組成的保守的AP2結(jié)構(gòu)域,三級結(jié)構(gòu)中含有3個反向平行的p折疊和一個幾乎與之相平行的α螺旋,并且其AP2結(jié)構(gòu)域中第14、19位的氨基酸殘基分別是丙氨酸和天冬氨酸,屬于典型的AP2/ERF家族中的ERF家族成員。實(shí)時定量PCR結(jié)果表明,SmERF1的表達(dá)受到茉莉酸甲酯(MeJA)以及酵母提取物(YE)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。2.采用Gateway法成功構(gòu)建了pEarleyGate100-SmERF1重組質(zhì)粒,并且通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別對丹參和煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)篩選培養(yǎng)和DNA檢測分別獲得丹參和煙草陽性轉(zhuǎn)化株系15個和5個。進(jìn)一步分析其表達(dá)水平,獲得高表達(dá)基因的丹參和煙草陽性轉(zhuǎn)化株系8個和4個。在組織培養(yǎng)狀態(tài)下,過表達(dá)SmERF1基因的煙草植株與野生型煙草相比出現(xiàn)了老葉泛黃、早花、生長緩慢等現(xiàn)象。3.對轉(zhuǎn)基因丹參和煙草中ABA、GA含量及其合成途徑中相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因丹參和煙草中ABA含量均明顯升高,同時GA含量降低；ABA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因NtSDR和乙烯合成途徑NtACS, NtACO等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)在過表達(dá)株系中高于野生型株系；赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因GA20ox的表達(dá)明顯下降。因此,我們推測,SmERF1基因可能通過調(diào)控ABA合成關(guān)鍵基因.NtSDR促進(jìn)了ABA的生物合成。ABA含量的增加一方面可能抑制了GA20ox基因的表達(dá)減少了GA的合成,另一方面可能促進(jìn)了乙烯合成關(guān)鍵基因ACS和ACO表達(dá),可能促進(jìn)乙烯合成。4.轉(zhuǎn)SmERFl基因煙草種子變小,千粒重約是野生型的0.55～0.63倍；且轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)速度較野生型慢。結(jié)合ABA和GA含量分析結(jié)果,我們推測轉(zhuǎn)基因煙草種子變小的表型可能源于ABA含量的增加；種子的萌發(fā)變慢,一方面可能受到種子大小的影響,另一方面也可能受到了ABA的抑制。5.用400mmol/LNaCl對轉(zhuǎn)基因丹參和煙草進(jìn)行鹽脅迫處理,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系抗鹽脅迫能力明顯高于野生型植株。處理7d后,轉(zhuǎn)基因株系長勢明顯優(yōu)于野生對照株系,其脯氨酸含量、SOD、POD活性較野生型高；MDA含量與野生型相比較低。我們推測SmERFl可能通過促進(jìn)ABA的生物合成,增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因丹參和煙草對高鹽的耐受性。6.采用HPLC法檢測丹參中主要有效成分的含量,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系1、16中隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量較野生型有所提高,但提高幅度很小,而轉(zhuǎn)基因株系11中四種次生代謝產(chǎn)物含量較野生型都有所減少。我們推測株系11可能是由于插入位置不同,導(dǎo)致其他丹參酮合成途徑相關(guān)的基因表達(dá)下降所致。綜上所述,SmERFl基因作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員,在植物種子大小決定、抵御鹽脅迫中起著重要作用,而在丹參次生代謝調(diào)控中的作用不大。
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【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S567.53

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1 孔維維;丹參抗性基因SmERF1的功能研究[D];陜西師范大學(xué);2016年

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本文編號：1620301