本文選題：手足口病　切入點(diǎn)：腸道病毒71型　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的]手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)是由腸道病毒引起的一種常見(jiàn)的兒童感染性疾病,臨床以手掌、足部和口腔出現(xiàn)不同程度皰疹為主要癥狀,可伴隨發(fā)熱、咽痛及腹瀉等,好發(fā)于5歲左右兒童群。相關(guān)研究顯示HFMD具有春末夏初發(fā)病的季節(jié)性和爆發(fā)流行亞型及地域時(shí)空分布差異性,受溫度,濕度和年齡等因素影響,主要通過(guò)消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播。病原體多數(shù)為腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A 16型(Coxsackievirus A16,CA16)及其他腸道病毒亞型群(Enterovirus, EVs) , EV71感染�？梢饑�(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)并發(fā)癥,如急性腦炎(Acute encephalitis)、腦膜炎(Meningitis),腦脊髓炎(Encephalomyelitis),遲緩性麻痹(Flaccid paralysis)等。EV71型擁有A、B和C 3種基因型,而其編碼質(zhì)粒蛋白VP1是最具致病性的也是最重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白,其變化是EV71免疫原性的主要決定因素,可以用于病毒的鑒定和進(jìn)化分析。本研究對(duì)臨床HFMD的EV71型分離毒株的VP1基因測(cè)序分析,從分子水平探究HFMD的分子遺傳進(jìn)化變遷情況,為篩查HFMD易感人群、評(píng)估發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。[方法]l研究對(duì)象:收集2015年1月至2016年12月期間在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院臨床就診疑似HFMD患者590例,其中男性355例,女性235例,年齡0至36歲,≤5歲470例,5歲至18歲118例,≥18歲2例。疑似患者主要因手掌、足部及口腔等部位出現(xiàn)皰疹為首發(fā)癥狀或者伴隨發(fā)熱、腹瀉等就診于我院皮膚科及兒科等臨床科室。2標(biāo)本采集及保存:參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病預(yù)防控制指南(2008年版)》。在研究對(duì)象知情同意的原則下,采集HFMD患者發(fā)病7日內(nèi)的5-8 g/份糞便標(biāo)本,用于病原檢測(cè)。采集后放入無(wú)菌采便管內(nèi)后立即送檢,不能及時(shí)檢測(cè)時(shí)一 20℃以下低溫冷凍保存,避免反復(fù)凍融。3 EV71型檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行EV71病毒核酸的檢測(cè),使用腸道病毒71型(EV71)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法),試劑盒由江蘇默樂(lè)生物科技有限公司提供,具體檢測(cè)步驟依據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。4病毒RNA提取:對(duì)EV71檢測(cè)陽(yáng)性病例臨床糞便樣本進(jìn)行EV71病毒RNA提取,使用核酸提取試劑盒(柱提法),試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供,具體操作步驟根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書。5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):以提取的EV71病毒RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由日本TaKaRa公司提供,具體操作步驟根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書。6 PCR反應(yīng)擴(kuò)增VP1目的基因:針對(duì)EV71的VP1基因用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)特異性引物,并由北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行引物合成,進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增VP1目的基因。7 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳:將PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物情況,拍照同時(shí)做好相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄。8 EV71型VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序:擴(kuò)增EV71型VP1目的基因后,將VP1陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物全部外送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行基因測(cè)序分析,根據(jù)測(cè)定EV71 VP1核苷酸序列,與基因庫(kù)(GenBank)中EV71相關(guān)參考毒株序列進(jìn)行比較鑒定,分析同源性并確定其所屬基因亞型。9構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):送檢EV71毒株與GenBank中EV71相關(guān)參考毒株序列進(jìn)行比較鑒定,測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN (5.1.0.0)軟件(美國(guó)LynnonBiosoft公司)進(jìn)行基因序列的比對(duì)和同源性分析,具體操作按照軟件使用說(shuō)明書進(jìn)行。另外利用 MEGA 4.0 軟件(http://www.megasoftware.net/ )采用鄰接法(neighbour-joining,NJ)和Kimura 2-parameter模型構(gòu)建種系遺傳變遷進(jìn)化發(fā)育樹(shù),自展值(bootstrap)為1000, 了解VP1基因的遺傳進(jìn)化特征以及與國(guó)內(nèi)外EV71型相關(guān)毒株之間的親緣關(guān)系。[結(jié)果]1檢出情況:2015年1月至2016年12月在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院就診的590例疑似HFMD患者中實(shí)驗(yàn)室檢查共檢出EV71型50例,檢出率為8. 47%(50/590例),其中2015年檢出28例,2016年檢出22例。50例中≤5歲35例,5-18 歲 13 例,≥ 18 歲 2 例;男性占 64. 00%(32/50 例),女性 36. 00%(18/50例),女性患者中包括2例成人HFMD患者。2測(cè)序分析:檢出的50株EV71毒株VP1基因測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果與GeneBank中EV71參考毒株(SequenceID: KU936121.1)進(jìn)行基因序列的比對(duì)和同源性分析,其同源性為97. 96%-99. 43%,并確定送檢毒株均為EV71 C4亞型。3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析:檢出的EV71毒株與北京(編號(hào):EV71strainBJ4211 VP1)、2008 年安徽合肥(編號(hào):EV71 isolate 1401-Luan(CHN)-08 VP1; EV71 isolate 1404-Luan(CHN)-08 VP1)以及馬來(lái)西亞沙撈越州地區(qū)EV71型流行毒株(編號(hào):EV71 isolate SB12007-SAR-03 VP1; EV71 isolate SB12278-SAR-03 VP1;EV71 isolate SB10712-SAR-03VP1)基因型共處于同一進(jìn)化譜系,遺傳距離較近。而與 2010 年浙江寧波(編號(hào):EV71 strain EV71/Ningbo. CHN/001/2010)、2014年上海(編號(hào):EV71 strain SHAPHC5251/SH/CHN/14 ; EV71 strain SHAPHC5330/SH/CHN/14) 、2014 年廣東深圳(編號(hào):EV71 isolate EV71/SZ07/CHN/2014; EV71 isolate EV71/SZ88/CHN/2014)、2013 年至 2014年浙江溫州(編號(hào):EV71 isolate EV71/P156/2013/China; EV71 isolate EV71/P654/2013/China; EV71 strain 15/EV71/Wenzhou/CHN/2014)等臨床流行地區(qū)分離的EV71型毒株遺傳距離較遠(yuǎn),遺傳距離為1.52。而與澳大利亞地區(qū)(編號(hào):EV71 strain 2978-SYD-92VP1; EV71 strain 7784-SYD-90VP1; EV71 strain 1182-SYD-91 VP1; EV71 strain 6560-SYD-86 VP1)分離的 EV71 毒株遺傳距離最遠(yuǎn),遺傳距離為2. 11。[結(jié)論]l同源性分析及鑒定:2015年1月至2016年12月分離出的50株EV71毒株VP1基因序列與GeneBank中EV71參考毒株Sequence ID:KU936121.1,序列同源性為97. 96%-99. 43%;均為EV71 C4亞型。2親緣進(jìn)化分析:構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)顯示EV71毒株2年間未發(fā)生大的基因遺傳變異,EV71毒株親緣關(guān)系與國(guó)內(nèi)北京和安徽合肥中部地區(qū)以及東南亞國(guó)家馬來(lái)西亞地區(qū)EV71分離毒株遺傳距離近;而與上海地區(qū),浙江寧波、溫州以及廣東深圳地區(qū)毒株親緣遺傳距離為1. 52,與澳大利亞地區(qū)EV71毒株遺傳距離為2. 11。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1612906