本文選題：骨肉瘤　切入點(diǎn)：ARHI　出處：《蘭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：骨肉瘤(Oseteosarcoma)亦稱為成骨肉瘤,是一種常見于兒童和青少年時(shí)期的惡性原發(fā)性骨腫瘤。早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移,死亡率高,是導(dǎo)致兒童和青少年死亡的最常見的疾病之一。其總體發(fā)病率各國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)字差異較大,約1/10萬~0.1/10萬。盡管當(dāng)前新的輔助化療及手術(shù)技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展和提高,骨肉瘤患者的生存率也因此顯著提高了,但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)化療效果差,容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況。近年來,隨著分子生物學(xué)研究和技術(shù)的不斷發(fā)展,骨肉瘤的最新研究已進(jìn)入基因治療、靶向治療階段,從分子水平研究腫瘤中相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生、演變、轉(zhuǎn)歸及治療具有重要意義。目前在腫瘤生物基因靶向治療及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制的研究方面出現(xiàn)了許多新的進(jìn)展,這為我們對(duì)骨肉瘤的預(yù)防和治療提供了新的方法和途徑。ARHI(aplasia ras homologue member I),是一個(gè)母源性印記基因。它又被稱為Di Ras3或NOEY2,于1999年被首次發(fā)現(xiàn)。近年來研究表明,其編碼蛋白在人類的胰腺、乳腺、卵巢等多個(gè)組織中存在著不同的表達(dá)。但是,它在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中則表現(xiàn)為表達(dá)缺失或下調(diào),提示ARHI基因與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。ARHI基因作為一個(gè)抑癌基因,其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面扮演著重要角色。ARHI作為一種新的研究目的基因,為腫瘤的分子水平基因治療探索提供了新的思路。ARHI基因在腫瘤中的應(yīng)用研究尚處于初始階段,迄今在國(guó)內(nèi)外的研究領(lǐng)域尚無關(guān)于骨肉瘤中ARHI基因的表達(dá)和ARHI基因?qū)侨饬錾飳W(xué)特性影響及相關(guān)機(jī)制研究的文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于上述原因,本實(shí)驗(yàn)將通過構(gòu)建目的基因ARHI穩(wěn)定表達(dá)的骨肉瘤MG-63、U2OS和SAOS-2細(xì)胞系,對(duì)ARHI基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況作以研究,并以此為依據(jù),深入探討ARHI基因?qū)侨饬錾飳W(xué)特性的影響及其作用機(jī)制,以期為骨肉瘤的基因診斷及治療提供更多理論支撐和依據(jù)。本研究共分為四部分:第一部分ARHI基因在人骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)及意義目的:研究ARHI基因在人骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討ARHI基因在人骨肉瘤中表達(dá)的生物學(xué)意義。方法:分為3種人骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63、U2OS、SAOS-2)和人正常成骨細(xì)胞h FOB1.19,采用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)ARHI基因m RNA和蛋白的表達(dá)情況,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,揭示在正常的成骨細(xì)胞中是否存在ARHI基因的表達(dá)以及其在人骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的變化情況。結(jié)果:(1)應(yīng)用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)了骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI基因m RNA及蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示其內(nèi)均存有不同程度ARHI基因表達(dá)。(2)RT-PCR顯示骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI m RNA表達(dá)水平低于正常成骨細(xì)胞,以MG-63細(xì)胞下降最為顯著,表達(dá)水平有顯著性差異(P0.05)。(3)Western blot法檢測(cè)結(jié)果:骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI蛋白表達(dá)水平低于正常成骨細(xì)胞,以MG-63細(xì)胞下降最為顯著,表達(dá)水平有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:ARHI基因在骨肉瘤細(xì)胞系中普遍低表達(dá),提示其表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),影響骨肉瘤的生物學(xué)行為。第二部分ARHI基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞陽性克隆穩(wěn)定株的構(gòu)建及鑒定目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因ARHI的骨肉瘤細(xì)胞系模型并進(jìn)行鑒定,為研究ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。方法:應(yīng)用基因克隆技術(shù),構(gòu)建真核表達(dá)載體pc DNA3.1-ARHI(攜帶目的基因ARHI基因編碼序列),將ARHI基因重組質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI和空載體質(zhì)粒pc DNA-3.1分別經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒提取擴(kuò)增和純化鑒定后,采用脂質(zhì)體法分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、U2OS、SAOS-2,通過G418篩選,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細(xì)胞系模型。擴(kuò)增培養(yǎng)后應(yīng)用RT-PCR及Western blot法分別檢測(cè)骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后目的基因ARHI在m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:(1)真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系和空載體pc DNA3.l轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系均獲得新霉素抗性,通過G418篩選,建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細(xì)胞系。(2)通過RT-PCR、Western blot法檢測(cè)顯示重組質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系后,目的基因ARHI在m RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均較空載體組和未轉(zhuǎn)染組有顯著增高(P0.05),而空載體組和未轉(zhuǎn)染組的ARHI表達(dá)則沒有明顯不同(P0.05)。結(jié)論:應(yīng)用基因克隆技術(shù)在體外成功構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因ARHI的骨肉瘤細(xì)胞系。第三部分ARHI基因調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移的體外研究目的:研究目的基因ARHI對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,證實(shí)其在骨肉瘤中的生物學(xué)作用。方法:以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達(dá)外源pc DNA3.1-ARHI、空載體pc DNA3.1的骨肉瘤細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象。(1)通過生長(zhǎng)曲線和MTT法分析ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖的影響;(2)流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡的影響。(3)通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)研究ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞侵襲遷移的影響。結(jié)果:(1)從骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)分析,ARHI組細(xì)胞生長(zhǎng)速度要比空載體組明顯減慢,ARHI基因抑制了骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),尤其在72~96h,與空載體組比較,具有明顯的差異性(P0.05)。(2)應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng),可見ARHI組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢,對(duì)MG-63、U2OS和SAOS-2細(xì)胞均有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,ARHI組與空載體組比較,具有明顯的差異性(P0.05)。(3)Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況,定量分析骨肉瘤MG-63細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHI組MG-63凋亡細(xì)胞的百分率為29.7%,空載體組為4.31%。與空載體組比較,ARHI基因明顯增加了細(xì)胞凋亡百分率(P0.05)。(4)通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)可以觀察到MG-63細(xì)胞在ARHI組較空載體組細(xì)胞侵襲能力明顯下降(P0.05);通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)可以觀察到MG-63細(xì)胞在ARHI組較空載體組細(xì)胞遷移能力明顯下降(P0.05)。結(jié)論:(1)ARHI基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖;(2)ARHI基因誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;(3)ARHI基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移;(4)ARHI基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中是一個(gè)抑癌基因。第四部分小干擾RNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞ARHI基因、蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)通路的影響目的:研究小干擾RNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞ARHI基因的表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、凋亡的影響;研究ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)通路和Caspase凋亡信號(hào)通路的影響。方法:使用化學(xué)合成法構(gòu)建針對(duì)ARHI的小干擾RNA,通過使用dharmafect4轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染入ARHI高表達(dá)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞。(1)通過RT-PCR、Western blot方法、MTT增殖實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)其對(duì)ARHI基因、蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、凋亡的影響;(2)通過Western blot方法檢測(cè)ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-Akt和Akt蛋白表達(dá)的作用;(3)通過Caspase-Glo?3/7試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因?qū)aspase-3活性的影響。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了針對(duì)ARHI基因的小干擾RNA;(2)通過RT-PCR檢測(cè)顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞48h后,與control si RNA轉(zhuǎn)染組比較,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中ARHI m RNA的表達(dá)水平下降約92%,具有明顯差異性(P0.05);(3)通過Western blot方法檢測(cè)顯示,與control si RNA轉(zhuǎn)染組比較,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組MG-63細(xì)胞中ARHI蛋白表達(dá)水平下調(diào),具有明顯差異性(P0.05);(4)應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖較control si RNA轉(zhuǎn)染組有所增加,具有明顯差異性(P0.05);(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染48h后MG-63細(xì)胞的凋亡率4.8%,明顯低于control si RNA轉(zhuǎn)染組31.1%,具有顯著差異性(P0.05);(6)在ARHI基因轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞72h后,觀察p-Akt蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染ARHI基因后,與空載體比較,發(fā)現(xiàn)磷酸化的p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而通過RNAi技術(shù)使ARHI基因沉默則顯著上調(diào)了p-Akt蛋白表達(dá),然而control si RNA轉(zhuǎn)染組p-Akt蛋白表達(dá)無明顯改變;(7)Caspase-Glo?3/7試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因轉(zhuǎn)染組與ARHI基因沉默組細(xì)胞中Caspase-3活性均較對(duì)照組無顯著改變(P0.05)。結(jié)論:(1)成功地合成了ARHI si RNA并將其轉(zhuǎn)染入骨肉瘤MG-63細(xì)胞;(2)發(fā)現(xiàn)ARHI si RNA能下調(diào)骨肉瘤MG-63細(xì)胞ARHI基因和蛋白的表達(dá)水平,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡;(3)ARHI基因下調(diào)了p-Akt蛋白的表達(dá),通過抑制PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程;(4)ARHI基因引起MG-63細(xì)胞凋亡可能與Caspase途徑無關(guān),具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1
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本文編號(hào)：1610269