發(fā)布時間：2018-03-13 20:19

  本文選題：冬凌草　切入點：轉(zhuǎn)錄組測序　出處：《河南中醫(yī)藥大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：1.選取合適的冬凌草材料進行轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析；2根據(jù)冬凌草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并選擇冬凌草甲素、冬凌草乙素合成途徑中DXR、IDI、ISPF. ISPH基因,進行大腸桿菌克隆、測序分析,獲得正確的基因序列信息；3.針對克隆測序的基因,分析其生物信息；4.分別對冬凌草無菌苗做不同部位的基因相對表達(dá)量分析；5.做原核表達(dá)分析,驗證克隆測序后基因的翻譯蛋白分子量大小,并為后期蛋白功能分析奠定基礎(chǔ)。方法：1.首先將含冬凌草甲素、冬凌草乙素較低產(chǎn)地的冬凌草無菌苗進行煉苗,使之能在室溫環(huán)境下進行生長,然后分別在冬凌草葉片表面噴施不同濃度的茉莉酸甲酯,測量噴施后0h、6h、12h、24h、48 h、72h后的冬凌草甲素含量,進而確認(rèn)含量變化最高點的材料。2.獲得冬凌草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后,根據(jù)冬凌草二萜類物質(zhì)合成代謝路徑,分別選擇5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(1-deoxy -D- lxyluloses-pho sphatereduet oi someras e,DXR)、異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI).2-C-甲基赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶(2-C-methyl -D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase ISPF)、二 甲 基烯 丙 基焦 磷 酸合 成 酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reducta se ISPH)并分別設(shè)計克隆引物,做大腸桿菌克隆測序分析,獲得正確基因序列。3.根據(jù)測序結(jié)果,在線BLAST同源性基因序列并采用在線軟件進行蛋白翻譯和生物信息分析。4.分別設(shè)計qRT-PCT引物,用熒光定量PCR儀做冬凌草無菌苗不同部位和添加刺激劑后脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)量分析。5.針對DXR、IDI、ISPF、ISPH基因設(shè)計原核表達(dá)引物,采用PET-28 a載體、BL21感受態(tài)細(xì)胞,做原核表達(dá)分析。結(jié)果：1.添加不同濃度的刺激劑后發(fā)現(xiàn)在36h內(nèi)冬凌草甲素含量變化不明顯,因此采用本實驗室前期多不同產(chǎn)地冬凌草的品質(zhì)評價后的含冬凌草甲素、冬凌草乙素較高(DLC-G)產(chǎn)地的冬凌草和含冬凌草甲素、冬凌草乙素較低(DLC-D)產(chǎn)地的冬凌草作為冬凌草轉(zhuǎn)錄組測序材料。2.分別提取冬凌草DLC-G、DLC-D樣品的mRNA,以mRNA為模板,研究得到cDNA文庫。以cDNA文庫作為轉(zhuǎn)錄組測序材料進行測序分析。DLC-G獲得50934276 reads,GC含量為48.06%；DLC-D獲得61561674 reads,GC含量為48.13%。共獲得44626條unigenes。對GLC-G、GLC-D差異基因的表達(dá)分析表明,DLC-G、DLC-D2個樣品共找到差異表達(dá)基因1298條,上調(diào)基因有339條,下調(diào)基因959條。3. DXR、IDI、ISPF、ISPH基因經(jīng)過大腸桿菌克隆測序分析,獲得了基因的序列,測序后的基因片段通過在線BLAST同源基因,最終確定下來了所選擇基因(DXR、IDI、ISPF、ISPH)的基因序列信息。4.序列翻譯后,發(fā)現(xiàn)DXR基因開放閱讀匡為1422bp,編碼473個氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為51390.2,等電點為6.09；IDI基因開放閱讀匡為906bp,編碼301個氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為27444.3,等電點為5.06；ISPF基因開放閱讀匡為708bp,編碼196個氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為20870.1,等電點為6.75；ISPH基因開放閱讀匡為1389bp,編碼462個氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為52094.0,等電點為5.82。5.不同部位基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)DXR基因在莖的表達(dá)量相對于根、葉較高,基本是其2倍,IDI基因在葉中的表達(dá)量較高,而在根和莖的表達(dá)量相差不大,ISPF基因在葉中的表達(dá)量最高,基本是在根中表達(dá)量的5倍,而其在莖中的表達(dá)量也基本是在根中表達(dá)量的3.8倍,ISPH基因在根、莖、葉中的表達(dá)量基本相同,三者之間差別不大；對于脅迫表達(dá)分析,茉莉酸甲酯促進DXR等4條基因的表達(dá),只是表達(dá)量不明顯,而赤霉素ATP、稀土元素鑭和鈰抑制其表達(dá),其中赤霉素的抑制作用最強。6.通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過夜后,做蛋白SDS-PAGE分析,誘導(dǎo)出了DXR、 ISPF、DXS基因蛋白。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R284

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1607996