本文選題：杜仲　切入點(diǎn)：3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因　出處：《中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：我國(guó)是世界上最大的天然橡膠消費(fèi)國(guó),而我國(guó)天然橡膠對(duì)外依存度卻高達(dá)80%以上,已超國(guó)家戰(zhàn)略安全警戒線。面對(duì)天然橡膠資源的短缺,新膠源物種的開(kāi)發(fā)迫在眉睫。杜仲橡膠是極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)質(zhì)天然橡膠資源,但因用于提取杜仲橡膠的原材料葉片和果實(shí)中橡膠產(chǎn)量相對(duì)較低,造成原料成本較高,嚴(yán)重制約著杜仲橡膠的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。而揭示杜仲橡膠生物合成過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)理有助于尋找提高杜仲橡膠產(chǎn)量的方法。本研究通過(guò)基因克隆、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、亞細(xì)胞定位、過(guò)量表達(dá)及啟動(dòng)子克隆和活性驗(yàn)證等方法對(duì)EuHMGR基因的表達(dá)模式和功能進(jìn)行了初步研究,并初步建立了杜仲組織培養(yǎng)體系,為揭示EuHMGR基因在杜仲橡膠生物合成過(guò)程中的分子作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:(1)克隆得到EuHMGR基因全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,EuHMGR基因ORF長(zhǎng)1770 bp,編碼590個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量為63 k Da,等電點(diǎn)為6.89;含有2個(gè)NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)GTVGGGT、DAMGMNM及2個(gè)HMG-Co A結(jié)合位點(diǎn)TTEGCLVA、EMPVGYVQIP,且與已知植物HMGR基因序列相似性達(dá)80%以上。(2)分析了EuHMGR基因表達(dá)模式與杜仲橡膠合成的相關(guān)性。通過(guò)分析不同時(shí)期不同組織EuHMGR基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),EuHMGR基因在杜仲果皮和葉片中均有表達(dá),果皮中EuHMGR基因的表達(dá)量在幼果時(shí)期(4月至5月)達(dá)到最大值,而葉片中EuHMGR基因的表達(dá)量在7月中旬達(dá)到最大值。不同時(shí)期果皮和葉片中EuHMGR基因表達(dá)模式和含膠增長(zhǎng)速率相關(guān)性分析顯示,果皮中EuHMGR基因的表達(dá)模式變化規(guī)律與含膠增長(zhǎng)速率變化規(guī)律在統(tǒng)計(jì)學(xué)水平呈顯著正相關(guān),而在葉片中兩者無(wú)相關(guān)性。(3)確定了EuHMGR基因編碼產(chǎn)物作用的位置。通過(guò)構(gòu)建EuHMGR與YFP的融合表達(dá)載體,并在煙草中瞬時(shí)表達(dá),分析EuHMGR的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明,EuHMGR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,與MVA途徑位于細(xì)胞質(zhì)中相符。(4)EuHMGR功能驗(yàn)證。通過(guò)構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體35S::EuHMGR,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化EuTIDS5轉(zhuǎn)基因煙草,篩選得到陽(yáng)性植株共28株,并對(duì)陽(yáng)性株系的EuTIDS5表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)EuTIDS5在過(guò)量表達(dá)EuHMGR煙草中的表達(dá)量有不同水平的提高,隨后,對(duì)陽(yáng)性株系異戊二烯含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)量表達(dá)植物的異戊二烯含量提高了4-13%,說(shuō)明EuHMGR的過(guò)量表達(dá)有利于EuTIDS5基因的表達(dá),從而提高反式異戊二烯的合成和積累。(5)克隆分析了EuHMGR基因的啟動(dòng)子并驗(yàn)證其啟動(dòng)子功能。克隆得到EuHMGR基因上游長(zhǎng)2104 bp的片段,序列分析表明,EuHMGR基因啟動(dòng)子含有大量TATA box、CAAT box等保守轉(zhuǎn)錄元件,此外,還含有與發(fā)育、激素響應(yīng)、非生物脅迫和生物脅迫等相關(guān)的順式作用元件。構(gòu)建植物表達(dá)載體p EuHMGR::GUS,在煙草中瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果表明,克隆得到的該序列能啟動(dòng)GUS報(bào)告基因的正常表達(dá),說(shuō)明其具有啟動(dòng)子功能。(6)以杜仲無(wú)菌苗下胚軸為外植體,初步構(gòu)建了杜仲組織培養(yǎng)體系。研究發(fā)現(xiàn)以MS(無(wú)機(jī)鹽)+B5(有機(jī)物)+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配方為:6-BA(1.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L);愈傷組織繼代培養(yǎng)基激素配方為:6-BA(0.5 mg/L)+NAA(0.5 mg/L),愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90%以上;分化培養(yǎng)基激素配方為:6-BA(1.0mg/L)+TDZ(1.0 mg/L)+NAA(0-0.15 mg/L),分化率在20%左右。生根培養(yǎng)基采用1/2MS+15 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,并把切口端在300 mg/L的無(wú)菌ABT生根粉溶液中浸泡5s效果最佳。
[Abstract]:China is the world's largest natural rubber consumption in China, and our dependence on foreign natural rubber was as high as 80%, has exceeded the national strategic security cordon. Facing the shortage of natural rubber resources, the development of new rubber source species is imminent. Eucommia rubber is a great potential for the development of high-quality resources of natural rubber, but because of the production of rubber rubber raw materials used for extracting Eucommia leaves and fruits were relatively low, resulting in high cost of raw materials, seriously restricting the industrial development of Eucommia rubber. And reveal the mechanism of gene regulation in the biosynthesis process of Eucommia rubber helps to find ways to improve the yield of rubber of Eucommia ulmoides. In this study, through gene cloning, quantitative real-time PCR excess, subcellular localization, expression and promoter activity of cloning and verification of EuHMGR gene expression pattern and function were studied, and the preliminary establishment of Du Zhong organization Training system, lay the foundation for revealing the molecular mechanism of EuHMGR gene in the process of Eucommia rubber biosynthesis. The main results are as follows: (1) cloned the full-length cDNA of EuHMGR gene and its bioinformatics analysis. The results showed that the EuHMGR gene of ORF 1770 BP in length, encoding 590 amino acids. The relative molecular mass of 63 K Da, the isoelectric point was 6.89; with 2 NADP (H) GTVGGGT binding sites, DAMGMNM and 2 HMG-Co A binding sites TTEGCLVA, EMPVGYVQIP, and HMGR gene sequences of known plant similarity was more than 80%. (2) analysis of the EuHMGR gene expression pattern and the synthesis of Eucommia rubber. Through the analysis of the expression pattern of EuHMGR gene in different tissues showed that EuHMGR gene in the pericarp and leaves of Eucommia ulmoides were expressed, expression of EuHMGR gene in the pericarp in young fruit period (April to May) reached the maximum value, and in the leaves of EuHMGR gene The expression reached the maximum in the middle of July. The analysis mode and the growth rate showed a correlation with EuHMGR glue peel and leaf gene expression in different periods, the expression pattern of EuHMGR gene variation in the pericarp and gum growth rate changes in the level of statistics showed a significant positive correlation, both in leaves no correlation (3) to determine. The EuHMGR gene encoding product function position. The expression vector of fusion constructs of EuHMGR and YFP, and in tobacco transient expression, subcellular localization analysis of EuHMGR. The results showed that EuHMGR located in the endoplasmic reticulum in the cytoplasm, consistent with the MVA pathway in. (4) EuHMGR functional verification. Through the construction of over expression vector 35S:: EuHMGR Agrobacterium mediated transformation, transgenic tobacco EuTIDS5, screened positive plants were 28 strains, and the positive expression of EuTIDS5 strains were detected, the expression of EuHMGR EuTIDS5 in the amount found The expression of tobacco in different level, then the positive strains of isoprene content were measured, results showed that overexpression of isoprene content in plants increased by 4-13%, indicating that EuHMGR overexpression facilitates the expression of EuTIDS5 gene, so as to improve the synthesis and accumulation of trans isoprene. (5) cloning and analysis of EuHMGR the gene promoter and verify its promoter function. The cloned EuHMGR gene upstream 2104 BP long fragment sequence analysis showed that EuHMGR gene promoter contains a lot of TATA box, CAAT box and other conservative transcription element, in addition, also contain and growth hormone responses to abiotic and biotic stress related cis element. To construct plant expression vector EuHMGR:: P GUS, the expression of instantaneous in tobacco. The results show that the normal expression of GUS gene promoter report the sequence cloned, shows its promoter . (6) in Eucommia aseptic seedling hypocotyl as explants, initially constructed Eucommia tissue culture system. The MS (inorganic salt) +B5 (organic) +30 g/L sucrose +6.0 g/L agar medium as basic medium, hormone induction medium formula for callus: 6-BA (1 mg/L +NAA (1) mg/L); callus subculture medium hormone formula was: 6-BA (0.5 mg/L) +NAA (0.5 mg/L), the callus induction rate was above 90%; the differentiation medium hormone formula was: 6-BA (1.0mg/L) +TDZ (1 mg/L) +NAA (0-0.15 mg/L), the differentiation rate in culture medium with left and right 20%. 1/2MS+15 g/L sucrose +6.0 g/L agar medium and rooting, the cut ends in a sterile ABT 300 mg/L rooting powder solution for 5S effect best.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S792.99

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本文編號(hào)：1606726