本文選題：Spata34基因　切入點：Mage-k1基因　出處：《湖南理工學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近十年來,育齡夫婦中約有10-15%的不育,而男性不育約占33.15%,其中一個重要的原因是男方生精障礙,表現(xiàn)為無精或嚴重少精。多個與精子發(fā)生或生精細胞凋亡相關(guān)的基因已被鑒定,但這些已知的基因如何與其它的基因相互作用來調(diào)控精子的生成過程,以及是否存在其它未知的基因參與精子的發(fā)生目前尚不完全清楚。因此,發(fā)現(xiàn)和克隆新的睪丸生精細胞發(fā)生、發(fā)育、凋亡特異基因并研究其功能對闡明精子發(fā)生的生理和病理機制具有十分重要的意義。在本研究中,應(yīng)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了兩個睪丸特異表達新基因Spata34和Mage-k1,并分別對其功能進行了初步研究。主要方法及實驗結(jié)果如下:1.克隆了兩個睪丸特異表達新基因Spata34和Mage-k1,并對其進行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明大鼠Spata34的cDNA全長為1986 bp,定位于2號染色體2q24區(qū),含有11個外顯子,編碼由415個氨基酸組成的分子量為46.47 kD的蛋白質(zhì),推測Spata34蛋白定位于細胞核。小鼠Mage-k1基因cDNA全長為1602 bp,定位于X號染色體XA6區(qū),含有2個外顯子,編碼由320個氨基酸組成的分子量為35.04 kD的蛋白質(zhì),可能為一種胞漿蛋白。2.對大鼠生精細胞凋亡相關(guān)基因Spata34進行了初步的功能研究。多組織RT-PCR結(jié)果顯示:在已檢測組織中,Spata34基因在正常大鼠睪丸組織中高表達,在卵巢組織中有微弱表達,而在其他組織中未檢測到表達。原位雜交結(jié)果顯示:Spata34在睪丸組織的精母細胞、精子中高表達,而在精原細胞中弱表達,提示Spata34基因可能在睪丸生殖細胞的發(fā)育過程中扮演著重要的角色。構(gòu)建了原核表達載體pET28b/Spata34,并誘導(dǎo)Spata34基因在大腸桿菌Rosetta中表達融合蛋白。亞細胞定位結(jié)果顯示:pEGFP-C3/Spata34質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞后,綠色熒光出現(xiàn)在胞核和胞漿,表明Spata34蛋白主要在胞核和胞漿中表達。3.對小鼠睪丸特異表達新基因Mage-k1進行了初步的功能研究。多組織RT-PCR結(jié)果顯示:Mage-k1基因在正常小鼠睪丸組織中特異性高表達,而在其他組織中未檢測出表達。小鼠不同發(fā)育時期睪丸組織RT-PCR結(jié)果顯示:Mage-k1基因在睪丸中的表達呈發(fā)育階段特異性,其在小鼠出生后1-4周低表達,此后隨著睪丸的發(fā)育其表達量逐步上升,并在性成熟時保持穩(wěn)定表達。原位雜交結(jié)果顯示:Mage-k1基因在睪丸組織的精母細胞、精子中高表達,而在精原細胞中不表達。成功構(gòu)建出原核表達載體pGEX-4T-2/Mage-k1及pET28b/Mage-k1,并誘導(dǎo)了Mage-k1基因在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白,用親和層析法純化了蛋白質(zhì),為后續(xù)Mage-k1基因功能的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)。以上實驗結(jié)果表明Spata34和Mage-k1基因與精子發(fā)生及生精細胞凋亡有關(guān),可能在精子發(fā)生、睪丸發(fā)育以及生精細胞凋亡中起重要作用。克隆Spata34和Mage-k1基因并研究其功能,將有助于探明精子發(fā)生的分子機制,并為男性不育患者的的診治以及新型避孕藥物的研制提供了新的靶標。
[Abstract]:In the past ten years, couples of childbearing age in about 10-15% of infertility, male infertility accounted for about 33.15%, one of the important reasons is the dyszoospermia, manifested as azoospermia or severe oligozoospermia. Multiple and spermatogenesis or spermatogenic cell apoptosis related genes have been identified, but these known genes to the interaction with other genes to regulate sperm generation process, and whether there are other unknown genes involved in sperm are still unclear. Therefore, the discovery and cloning of new spermatogenic cells, development, apoptosis gene and study its function has very important significance to elucidate the physiological and pathological mechanism spermatogenesis. In this study, using methods of bioinformatics and molecular biology technology combined with the cloned two testis specific expressed gene Spata34 and Mage-k1 respectively, and the main functions of the Main research method and the experimental results are as follows: 1.. Cloning of two testis specific expressed gene Spata34 and Mage-k1, and has carried on the analysis of biological information system science. The results showed that rat cDNA full-length Spata34 was 1986 BP, located on chromosome 2 2q24, contains 11 exons, molecular weight by encoding 415 amino acids of 46.47 kD proteins, suggesting that Spata34 protein was localized in the nucleus of mouse Mage-k1 gene. The full-length cDNA was 1602 BP, located at X on chromosome XA6, contains 2 exons, encoding the molecular weight of 320 amino acids of 35.04 kD protein may be a cell plasma protein.2. for further research on rat spermatogenic cell apoptosis related gene Spata34. RT-PCR results showed that: in detected tissues, high expression of Spata34 in testicular tissue of normal rats, in ovarian tissue is weak Expression in other tissues was not detected. In situ hybridization results showed that Spata34 in the testis spermatocyte, high expression of sperm, and weak expression in spermatogonia, suggesting that the Spata34 gene may play an important role in the development of testicular germ cells. To construct prokaryotic expression vector pET28b/Spata34, and induce the expression of the fusion protein of Spata34 gene in Escherichia coli Rosetta. The results showed: the subcellular localization of pEGFP-C3/Spata34 plasmid transfected COS-7 cells, green fluorescence appeared in the nucleus and cytoplasm, showed that Spata34 protein was mainly expressed in the nucleus and cytoplasm of mouse testis specific expression of.3. Mage-k1 gene for further research many organizations. RT-PCR results showed that the high expression of Mage-k1 gene in the testis of normal mice, while in other tissues did not detect the expression in different development period. Testicular tissue RT-PCR results showed that the expression of Mage-k1 gene in the testis in a developmental stage specific in mice 1-4 weeks after birth, low expression, then with the development of the testes of the expression level gradually increased, and remained stable in the mature expression. In situ hybridization results showed that Mage-k1 gene in spermatocytes of testis. The high expression of sperm, but not expressed in spermatogonia. Successfully constructed the prokaryotic expression vector pGEX-4T-2/Mage-k1 and pET28b/Mage-k1, and induced expression of Mage-k1 fusion protein in Escherichia coli BL21. The proteins were purified by affinity chromatography, and laid a good foundation for further in-depth study of Mage-k1 gene function. The experimental results show that the above Spata34 and Mage-k1 gene and spermatogenesis and apoptosis of spermatogenic cells, probably in spermatogenesis, testis, spermatogenic cell apoptosis plays an important role in the cloning of Sp. The function of ata34 and Mage-k1 genes will help to identify the molecular mechanism of spermatogenesis, and provide a new target for the diagnosis and treatment of male infertility and the development of new contraceptive drugs.

【學(xué)位授予單位】：湖南理工學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R698.2

【參考文獻】

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本文編號：1606134