本文選題：Dnajc5b　切入點(diǎn)：克隆　出處：《湖南理工學(xué)院》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：小鼠Dnajc5b和Rcet1基因是我們克隆的分別在小鼠睪丸和生殖域特異表達(dá)的新基因。Dnajc5b是DNAJ(HSP40)的同源物,亞家族C,成員5中的第二個(gè),故命名Dnajc5b,該基因位于小鼠第三號(hào)染色體,含五個(gè)外顯子,總長(zhǎng)度為947bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?97bp,共編碼199個(gè)氨基酸。通過(guò)多組織RT-PCR檢測(cè),Dnajc5b在小鼠睪丸組織中特異表達(dá);小鼠睪丸不同時(shí)期RT-PCR檢測(cè)出,Dnajc5b在小鼠出身后第一周、第二周弱表達(dá),第三周開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng),第八周性成熟時(shí)表達(dá)最大。同時(shí),原位雜交結(jié)果表明,Dnajc5b基因在小鼠精原細(xì)胞中特異表達(dá)。pEGFP-C3/Dnajc5b轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明Dnajc5b蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。Dnajc5b原核表達(dá)得到了25KD左右的融合蛋白,利用His抗體通過(guò)Western Blot檢測(cè)正確;同時(shí)對(duì)Dnajc5b融合蛋白進(jìn)行分離純化,得到純化后的Dnajc5b蛋白,經(jīng)6his抗體檢測(cè)正確。通過(guò)點(diǎn)突變內(nèi)含子和外顯子之間的剪接位點(diǎn)gt和ag,致使內(nèi)含子無(wú)法剪切而得不到成熟的mRNA,本實(shí)驗(yàn)室得到了敲除Rcet1的小鼠模型;檢測(cè)結(jié)果表明:敲除Rcet1雄性小鼠完全不育;睪丸和附睪不能正常發(fā)育,睪丸萎縮,附睪囊腫;曲精小管中精母細(xì)胞核變大、出現(xiàn)多核細(xì)胞、精子嚴(yán)重不足;附睪管管腔變大、柱狀細(xì)胞脫落、精子數(shù)量極少。Dnajc5b研究表明,Dnajc5b在睪丸組織中特異表達(dá),其表達(dá)量與睪丸發(fā)育時(shí)期呈正相關(guān);由于Dnajc5b含有Dnaj結(jié)構(gòu)域和HSP40的結(jié)構(gòu)位點(diǎn),其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中,Dnajc5b可能具有分子伴侶或熱休克蛋白的功能。Rcet1敲除小鼠表明,缺乏Rcet1的小鼠睪丸和附睪不能正常發(fā)育,顯示少精或者無(wú)精,表現(xiàn)為雄性不育。本文對(duì)Dnajc5b和Rcet1的研究結(jié)果,為進(jìn)一步研究其生精過(guò)程中的分子機(jī)制打下了一定的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Mouse Dnajc5b and Rcet1 genes are the second in the subfamily C5, which is a novel gene specifically expressed in mouse testis and reproductive domain, respectively. Dnajc5b is located on chromosome 3 of mice. It contains five exons with a total length of 947 BP and an open reading frame of 597 BP, encoding 199 amino acids. The specific expression of Dnajc5b in mouse testis was detected by multitissue RT-PCR, and the first week after mouse testicular RT-PCR was detected by RT-PCR at different stages of mouse testis, the total length of Dnajc5b was 997 BP, and the total length of Dnajc5b was 597 BP. The expression was weak at the second week, increased at the third week, and reached the highest at the sexual maturity of 8th weeks. At the same time, The results of in situ hybridization showed that the specific expression of Dnajc5b gene in mouse spermatogonia. PEGFP-C3 / Dnajc5b transfection experiment showed that the Dnajc5b protein expressed in the cytoplasm and expressed in prokaryotic expression of about 25KD fusion protein, which was correctly detected by Western Blot using His antibody. At the same time, the Dnajc5b fusion protein was isolated and purified, and the purified Dnajc5b protein was obtained. By 6his antibody, the splicing sites between point mutation intron and exon were correct. The mouse model of knockout Rcet1 was obtained by using the splicing sites gt and ag. the intron could not be cut and could not be mature. The results showed that the male knockout Rcet1 mice were completely infertile; the testis and epididymis did not develop normally, the testis atrophy, and the epididymal cyst; the seminiferous nucleus became larger in the seminiferous tubule, the multinucleated cells appeared, and the sperm was severely deficient; the epididymal duct lumen became larger. The columnar cells shed, the sperm count was very few. Dnajc5b was expressed specifically in testis, and the expression of Dnajc5b was positively correlated with testicular development, because Dnajc5b contained the Dnaj domain and the structural site of HSP40. The subcellular localization of Dnajc5b in the cytoplasm may have the function of molecular chaperone or heat shock protein. Rcet1 knockout mice showed that the testis and epididymis of Rcet1 deficient mice could not develop normally, indicating oligozoospermia or azoospermia. The results of the study on Dnajc5b and Rcet1 lay a foundation for further study on the molecular mechanism of spermatogenesis.
【學(xué)位授予單位】：湖南理工學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1602087