本文選題：家蠶　切入點：BmNPC1　出處：《西南大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人類C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C,NP-C)是一種罕見的,進展性的且不可逆的疾病,為常染色體隱性遺傳,常導致神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失甚至早逝。95%患者是由于NPC1基因突變導致的膽固醇代謝障礙,另5%是NPC2基因突變所致。作為導致C型尼曼匹克病的主要因素,NPC1參與細胞內的膽固醇運輸,編碼位于溶酶體和核內體膜上的13次跨膜蛋白。NPC1突變的細胞內膽固醇異常堆積于核內體/溶酶體中。NPC1基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有較多的功能,主要是:NPC1參與運輸細胞內膽固醇;NPC1蛋白又被證實有跨膜分子泵活性;在針對于埃博拉病毒的研究中,NPC1蛋白被發(fā)現(xiàn)與埃博拉病毒感染細胞相關。以果蠅為例的昆蟲中NPC1參與膽固醇運輸外還被發(fā)現(xiàn)與蛻皮以及精子形成相關,且有兩個直系同源物,NPC1a和NPC1b。而關于家蠶中NPC1基因功能尚無報道。為探索其在家蠶中功能,克隆得到了家蠶NPC1基因,并分析了其表達情況。之后制備了該基因的多克隆抗體。最后通過dsRNA干涉技術對BmNPC1基因的功能進行進一步的研究。主要研究結果如下:1.家蠶Bm NPC1基因全長克隆及信息分析利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI等數(shù)據(jù)庫,對NPC1進行基本信息分析及比對并設計引物,BmNPC1的全長通過RACE技術獲得。BmNPC1基因cDNA全長4591bp,其中ORF閱讀框為3702bp,位于第三號染色體上。編碼1233個氨基酸,蛋白大小為137.44kD,含有一個膽固醇結合結構域,且該蛋白13次跨膜。選取各物種的NPC1蛋白序列,構建系統(tǒng)發(fā)生樹,結果顯示BmNPC1與果蠅的NPC1親緣關系最近。2.家蠶Bm NPC1的表達分析取家蠶五齡三天的所有組織和從四齡至熟蠶整個時期的家蠶血液,并用來提取cDNA作為模板,通過qRT-PCR檢測BmNPC1的表達情況。結果表明,BmNPC1在五齡三天所有組織中表達,且在精巢、卵巢以及血液和馬氏管中表達量比較高。在血細胞中的表達量與時期相關,當家蠶處于變態(tài)期時該基因大量表達。3.家蠶Bm NPC1抗體的制備及檢測BmNPC1的多克隆抗體通過以下四步制備:構建重組的原核表達載體pET32,通過IPTG誘導蛋白的大量表達,在包涵體中的蛋白的純化,以及5次小鼠免疫。最終獲得了BmNPC1的小鼠多克隆抗體。利用ELISA測定抗體效價,之后Western blot檢測獲得的條帶大小與BmNPC1預測的蛋白分子量一致。家蠶血液和家蠶細胞系(SID-1)的免疫熒光實驗表明,與哺乳動物相同(NPC1蛋白定位于溶酶體膜和核內體膜),BmNPC1蛋白同樣出現(xiàn)在細胞質中。表明抗體制備有效,可用的,為下一步實驗做了良好的基礎。4.利用dsRNA干涉技術研究Bm NPC1基因功能設計并合成雙鏈干涉片段,細胞水平上通過雙鏈干涉片段干涉SID-1細胞,FilipinⅢ染色發(fā)現(xiàn)細胞中膽固醇發(fā)生明顯聚集,推測家蠶BmNPC1與細胞的膽固醇運輸相關;個體水平上雙鏈干涉片段注射蠶體,一定量的家蠶蛻皮推遲,另有一部分沒有完成蛻皮并死亡,推測該基因與家蠶蛻皮過程相關。
[Abstract]:Niemann-Pick disease type CNP-C) is a rare, progressive and irreversible disease with autosomal recessive inheritance. Some 95% of patients with neurological dysfunction or even premature death are due to cholesterol metabolism due to mutations in the NPC1 gene and 5% to mutations in the NPC2 gene. NPC1 is involved in the transport of cholesterol in cells as a major factor leading to type C Neimanpik disease. The cellular cholesterol abnormal accumulation of 13 transmembrane protein. NPC1 mutations on lysosome and intranuclear membranes has been found to have many functions in the nucleosome / lysosome. It was found that the protein of 1: NPC1 was involved in the transport of cholesterol and NPC1 protein and had transmembrane molecular pump activity. In the Ebola virus study, NPC1 protein was found to be associated with Ebola virus-infected cells. In Drosophila, for example, NPC1 involved in cholesterol transport was also found to be associated with molting and spermatogenesis. There are two direct homologues, NPC1a and NPC1b.However, the function of NPC1 gene in Bombyx mori has not been reported. In order to explore its function in silkworm, the NPC1 gene of Bombyx mori was cloned. Then the polyclonal antibody of the gene was prepared. Finally, the function of BmNPC1 gene was further studied by dsRNA interference technique. The main results were as follows: 1.Full-length cloning of BmNPC1 gene of Bombyx mori and. Information analysis and use of silkworm genome database and NCBI database, The full length of NPC1 gene BmNPC1 was analyzed and compared with that of primer BmNPC1. The full length of BmNPC1 gene cDNA was obtained by RACE technique. The ORF reading frame was 3702 BP, which was located on chromosome 3 and encoded 1233 amino acids. The protein is 137.44kD. it contains a cholesterol binding domain, and the protein transmembrane 13 times. The phylogenetic tree was constructed by selecting the NPC1 protein sequences of each species. The results showed that the relationship between BmNPC1 and Drosophila NPC1 was the most recent .2.The expression of BmNPC1 in Bombyx mori was analyzed. All tissues of Bombyx mori and the blood of silkworm from 4th instar to mature silkworm during the whole period from 4th instar to mature silkworm were collected and used to extract cDNA as template. The expression of BmNPC1 was detected by qRT-PCR. The results showed that the expression of BmNPC1 was higher in spermary, ovary, blood and Markov tube than in all tissues on the 3rd day of fifth instar. The expression of BmNPC1 in blood cells was correlated with the period. When Bombyx mori is in metamorphosis stage, the BmNPC1 antibody of Bombyx mori and the polyclonal antibody to detect BmNPC1 are prepared in the following four steps: construct the recombinant prokaryotic expression vector pET32, and induce protein expression by IPTG. The protein in inclusion body was purified and immunized for 5 times. Finally, the polyclonal antibody of BmNPC1 was obtained. The antibody titer was determined by ELISA. The size of the band detected by Western blot was the same as that of the protein predicted by BmNPC1. The immunofluorescence assay of silkworm blood and silkworm cell line (SID-1) showed that, The same NPC1 protein was located in the cytoplasm of lysosomal membrane and nuclear membrane, indicating that the preparation of antibodies was effective and useful. 4. Using dsRNA interference technique to study the function of Bm NPC1 gene design and synthesis of double strand interference fragment. At the cellular level, we found that the cholesterol concentration in SID-1 cells was significantly aggregated by double-strand interference fragment interference (SID-1) staining, which suggested that BmNPC1 was related to cholesterol transport in silkworm cells, while at individual level, double-strand interference fragments were injected into silkworm body. A certain amount of silkworm molting was delayed, while others did not complete molting and died. It is speculated that the gene is related to the molting process of Bombyx mori.
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R596.1;Q78

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本文編號：1599352