本文選題：大豆　切入點(diǎn)：7S伴大豆球蛋白　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：7S球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的重要組分也是主要的致敏原。其亞基缺失突變體可以在去除致敏蛋白的同時(shí)改善大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)。目前α亞基缺失的等位變異對(duì)種子蛋白營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)的作用及貢獻(xiàn)大小尚無(wú)充分研究,其分子機(jī)制尚未解析。近等基因系(NILs)是理論上可以最大限度排除遺傳背景干擾,使單基因效應(yīng)得以充分表達(dá)的理想遺傳學(xué)材料。本研究首先利用父母本間307個(gè)均勻分布于大豆20個(gè)連鎖群的SSR差異引物對(duì)‘?-亞基缺失型’近等基因系候選群體進(jìn)行全基因組遺傳背景掃描,2014年底完成了近等基因系預(yù)備群體全面、系統(tǒng)的分子水平的近等性評(píng)價(jià),綜合嚴(yán)謹(jǐn)、系統(tǒng)的形態(tài)相似性評(píng)價(jià),完成了一對(duì)以中國(guó)高油大豆‘東農(nóng)47’為遺傳背景的‘致敏蛋白?-亞基缺失型’單基因近等基因系‘cgy-2-NIL’的創(chuàng)制。‘cgy-2-NIL’的創(chuàng)制,為α-亞基缺失優(yōu)異等位基因分子水平上的遺傳學(xué)研究、及其在低致敏大豆分子育種中的應(yīng)用提供了理想的、永久性遺傳學(xué)材料平臺(tái)。目前,α-亞基缺失的等位變異對(duì)種子蛋白品質(zhì)的具體影響及其對(duì)缺失體品質(zhì)改良貢獻(xiàn)的大小尚無(wú)定論,其分子機(jī)制尚未解析。本研究以α單亞基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’為材料,通過(guò)對(duì)‘cgy-2-NIL’及其輪回親本‘東農(nóng)47’進(jìn)行氨基酸組分、及豆腐加工特性的測(cè)定分析,研究α缺失等位基因cgy-2對(duì)大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)及豆腐加工品質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響及貢獻(xiàn)率,以期明確α-亞基缺失等位基因的遺傳學(xué)效應(yīng)。RNA-Seq是最近發(fā)展起來(lái)的利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于大豆種子發(fā)育轉(zhuǎn)錄水平的研究。大豆種子發(fā)育過(guò)程中貯藏蛋白的合成主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,轉(zhuǎn)錄組水平基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)的獲得是透徹解析大豆致敏蛋白亞基缺失突變體遺傳機(jī)制必不可少的任務(wù)之一,為了進(jìn)一步尋找與α-缺失突變體相關(guān)的關(guān)鍵基因,本研究采用RNA-Seq技術(shù),利用α-亞基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’對(duì)?-缺失突變體進(jìn)行五個(gè)發(fā)育時(shí)期(花后18、25、35、50、和55天)轉(zhuǎn)錄組差異比較。具體結(jié)果如下:(1)經(jīng)過(guò)4代回交,綜合SSR標(biāo)記全基因組遺傳背景掃描及嚴(yán)格的形態(tài)相似性評(píng)價(jià),本研究成功創(chuàng)制了以中國(guó)高油大豆‘東農(nóng)47’為遺傳背景的?-亞基缺失型近等基因系(NIL),將其命名為‘cgy-2-NIL’�！甤gy-2-NIL’僅在第20號(hào)染色體上存在?-亞基缺失基因cgy-2的單一導(dǎo)入片段、其綜合農(nóng)藝性狀各個(gè)指標(biāo)與其輪回親本‘東農(nóng)47’基本一致,利用該近等基因系可以最大限度的降低遺傳背景的干擾、精準(zhǔn)的分析?-缺失基因的遺傳效應(yīng)、是α-亞基缺失基因精細(xì)定位,圖位克隆及相關(guān)基因功能驗(yàn)證研究理想的遺傳學(xué)材料平臺(tái)。(2)近等基因系‘cgy-2-NIL’的粗蛋白含量,氨基酸總量,必須氨基酸總量,含硫氨基酸含量(蛋氨酸+半胱氨酸)分別比輪回親本‘東農(nóng)47’高出4.11,4.16,5.20和11.96個(gè)百分點(diǎn)�！甤gy-2-NIL’中必須氨基酸組分:蘇氨酸(Thr),纈氨酸(Val),蛋氨酸(Met),異亮氨酸(Ile)含量的顯著增加導(dǎo)致其必須氨基酸總量明顯高于對(duì)照'東農(nóng)47'�！甤gy-2-NIL’蛋氨酸含量的顯著增加是導(dǎo)致其含硫氨基酸總量(Met+Cys)顯著高于‘東農(nóng)47’的主要原因。(3)成熟種子‘cgy-2-NIL’游離精氨酸的含量是‘東農(nóng)47’的兩倍�！甤gy-2-NIL’中,游離精氨酸含量占其游離氨基酸總量的36.81%,游離天門冬氨酸(Free Asp)和游離谷氨酸(Free Glu)分別占11.63%和9.32%,其余的游離氨基酸組分占‘cgy-2-NIL’游離氨基酸總量的42.24%。游離精氨酸含量的大幅增加是‘cgy-2-NIL’游離氨基酸總量顯著高于對(duì)照‘東農(nóng)47’的主要原因。(4)近等基因系‘cgy-2-NIL’TEAA及EAAI的得分都顯著高于‘東農(nóng)47’�？梢�(jiàn),致敏蛋白α亞基缺失,在降低致敏率的同時(shí),可以提高氨基酸總量,改善氨基酸品質(zhì)。(5)通過(guò)RNA-Seq測(cè)序,在‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’兩材料間,共檢測(cè)到20,295個(gè)表達(dá)有顯著差異的基因。其中花后18、25、35、50及55天時(shí),‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’間表達(dá)有顯著差異的基因數(shù)分別是174、151、123、158和2837個(gè)。本研究所檢測(cè)到的差異基因幾乎都具有發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)特異性,在花后55天時(shí)二者間顯著差異表達(dá)的基因數(shù)目最多,只有17個(gè)基因在五個(gè)發(fā)育時(shí)期內(nèi)全部差異表達(dá);‘顯著差異表達(dá)排名前20的基因’主要集中在花后18天及花后55天,花后18天差異表達(dá)的基因,可以認(rèn)定為是決定α-缺失特性的關(guān)鍵基因,開(kāi)花后55天差異表達(dá)的各個(gè)基因,則可以認(rèn)定為是突變體應(yīng)對(duì)蛋白組分改變、保持蛋白品質(zhì)的關(guān)鍵基因。(6)Gene Ontology(GO)分析結(jié)果表明,花后18、35、55天差異基因GO分類的結(jié)果大體類似,但花后25及50天時(shí)差異基因GO富集的分類特點(diǎn)截然不同。在18、25、35、50和55天,‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’之間分別鑒定出16條、3條、9條、4條和12條pathway。特別值得關(guān)注的是花后18天時(shí),檢測(cè)到多個(gè)差異表達(dá)基因被富集在氨基酸代謝途徑及脂肪酸代謝途徑中。(7)五個(gè)發(fā)育期,共鑒定到74個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因在α-亞基缺失突變體‘cgy-2-NIL’內(nèi)發(fā)生差異表達(dá),其中GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的差異表達(dá)基因數(shù)目最多。多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因在花后55天時(shí)差異表達(dá),花后50天時(shí)檢測(cè)到的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子最少。13個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在花后55天時(shí)全部下調(diào)表達(dá)。(8)‘cgy-2-NIL’中,有18個(gè)差異表達(dá)基因被注釋為編碼Cupin過(guò)敏蛋白,α-亞基缺失導(dǎo)致突變體內(nèi)幾乎所有7S球蛋白亞基(α′、α、?-亞基)與11S球蛋白亞基(Gy1-、Gy2-、Gy3-、Gy4-、Gy5-亞基)基因在多數(shù)發(fā)育期內(nèi)均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。Gl YMA20G28660(即α-亞基基因)是所有差異表達(dá)基因中,在花后25、35、和50天時(shí)均顯著下調(diào)表達(dá)的基因,α-亞基缺失突變體‘cgy-2-NIL’11S球蛋白Gy3與Gy7亞基基因的表達(dá)模式與Gy1 Gy5亞基不同。突變體‘cgy-2-NIL’內(nèi)7S與11S球蛋白Cupin過(guò)敏蛋白家族基因的協(xié)同下調(diào)表達(dá),是α-亞基缺失突變體致敏性降低的主要原因。(9)為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,選取分別在五個(gè)發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的六個(gè)基因,在大豆籽粒發(fā)育的18、25、35、50和55天進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,檢測(cè)結(jié)果與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果相符,證明RNA-Seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1591005