本文關(guān)鍵詞：利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

數(shù)字PCR用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè),更加靈敏,更便捷

利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)

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EstimatingtheExogenousGenesCopyNumberofGeneticallyModifiedOrganismsbyDropletDigitalPCR

0引言

在轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)與安全評(píng)價(jià)過程中，外源基因整合進(jìn)入受體基因組的方式(位置、拷貝數(shù)和旁側(cè)序列等)會(huì)影響目的基因和蛋白的表達(dá)以及外源基因的遺傳穩(wěn)定性,特別是整合的拷貝數(shù)多少影響尤為重要(Vaucheretetal.,1998)。因此，轉(zhuǎn)基因生物外源基因整合的拷貝數(shù)分析是關(guān)鍵步驟之一，同

時(shí)也是生物安全評(píng)價(jià)的重要評(píng)價(jià)參數(shù)。目前，Southernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR是常用的兩種外源基因拷貝數(shù)分析技術(shù),已廣泛用于外源基因拷貝數(shù)分析。但這兩種方法也存在一定缺陷。例如，Southernblot方法分析時(shí)工作量大、周期長(zhǎng)、操作要求高、準(zhǔn)確性較差，特別是對(duì)于多拷貝基因的分析，

結(jié)果容易偏小(Yangetal.,2005)。qRT-PCR在分析

外源基因拷貝數(shù)時(shí)必須依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知拷貝數(shù)的基因，只是一種相對(duì)定量方法，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量易受到DNA純度、引物和探針的濃度、反應(yīng)

抑制因子等諸多因素影響(Cankaretal.,2006)；另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須基于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類有限和昂貴價(jià)格不能適用于所有的研究。微滴數(shù)字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是近年來興起的一種新的絕對(duì)定量技術(shù)，通過極度稀釋實(shí)現(xiàn)理論上的單分子擴(kuò)增，然后用終點(diǎn)法PCR和泊松分布計(jì)算出樣品的原始濃度(Hindsonetal.,

2011)。目前，芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)已經(jīng)用于測(cè)量轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的定量分析(Corbisieretal.,2010)，但基于微滴數(shù)字PCR平臺(tái)的轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析工作報(bào)道較少。本研究基于ddPCR平臺(tái)，，建立了轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因山羊的外源基因拷貝數(shù)分析方法，并與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和已報(bào)道的Southernblot結(jié)果進(jìn)行了比較，研究結(jié)果為分析外源基因拷貝數(shù)提供了新的方法和借鑒。1

材料與方法

1.1

材料與試劑

轉(zhuǎn)基因水稻(Oryzasativa)T1c-19材料由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因(humanlactoferrin,HLF)山羊(Caprahircus)134血液樣品由上海杰隆生物科技有限公司提供。DNeasy®PlantMiniKit(QIAGEN,德國)。Quant-iTTMPicoGreen®dsDNAKit(Invitrogen,美國)。ddP-CRMasterMix(Bio-Rad,美國)。DropletGenera-tionOil(Bio-Rad,美國)。DropletReaderOil(Bio-Rad,美國)。1.2

實(shí)驗(yàn)儀器

NanodropND-1000核酸蛋白定量?jī)x(Thermo

Scientific，美國)。DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司,上海)。UVPBiodoc-It220凝

膠成像一體機(jī)(SpringScientific,美國)。SynergyTM2多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國)。QX100TMDropletDigitalTMPCR系統(tǒng)(Bio-Rad,美國,包括微滴生成儀和微滴讀取儀)。ABI7900定量PCR儀(AppliedBiosystem,美國)。1.3方法

1.3.1DNA提取和純化

轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNAT1c-19使用Qiagen公司生產(chǎn)的DNeasyPlantMiniKit純化，轉(zhuǎn)HLF基因

羊134血液DNA使用天根公司生產(chǎn)的血液DNA提

取試劑盒純化，

具體步驟見試劑盒說明書。所得基因組DNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop

ND-1000核酸蛋白定量?jī)x評(píng)價(jià)純度，

再通過Quant-iTTM

PicoGreendsDNA試劑盒測(cè)定濃度。1.3.2

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

為獲得準(zhǔn)確的qRT-PCR定量結(jié)果，本研究通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒來建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用重疊PCR，將定量分析的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性片段連接起來，再連接到pMD-18T載體中，使用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布平板挑選單克隆菌落，將菌落擴(kuò)繁培養(yǎng)并取菌液進(jìn)行PCR鑒定，出現(xiàn)目的條帶后測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果無誤后，最終獲得可用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。圖1為構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒示意圖。1.3.3

引物和探針

實(shí)驗(yàn)中涉及的定性、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

引物和探針通過軟件primerexpressv2.0設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成，具體序列見表1。其中，轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19的外源基因殺蟲晶體蛋白基因(in-secticidalcrystalprotein,Cry1C*)(GenBankNo.HM107006)能夠編碼Bt毒蛋白，使T1c-19具有抗蟲特性，外源基因膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphi-

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