RNA甲基化作為一種表觀遺傳標記,在基因調控中發(fā)揮著重要作用。至今為止,已發(fā)現RNA存在著100多種修飾,其中甲基化是主要的修飾形式,6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是最具有代表性的兩種甲基化修飾。有研究表明RNAm5C修飾在生物體的發(fā)育以及癌癥的發(fā)生中起重要作用。最初被認為是DNA甲基轉移酶的TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1)近十年來被證實是RNA m5C甲基轉移酶,催化tRNA產生5-甲基胞嘧啶修飾。最近有研究發(fā)現TRDMT1基因對器官形成、生物體的發(fā)育以及疾病的發(fā)生有影響。然而,對TRDMT1調控這些過程的分子機制尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9誘導的同源重組技術在RNA甲基化酶TRDMT1基因的轉錄起始位點上敲入轉錄終止序列BGH ploy(A),終止TRDMT1的表達從而達到敲除的目的。通過構建TRDMT1敲除的HEK293細胞系,研究TRDMT1去表達對細胞表型以及其他基因表達的影響,從而了解TRDMT1基因的功能,為研究RNAm5C甲基化的功能提供新思路。主要的研究方法與結果如下:1、建...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系統的作用原理（引用）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ??

被改編為一個基因編輯工具，改造后的系統包含兩部分：向導ＲＮＡ?（ｓｉｎｇｌｅ?ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，??ｓｇＲＮＡ）和Ｃａｓ９蛋白。ｓｇＲＮＡ是人工合成的一段能夠識別目標序列的ＲＮＡ序列，其中包??含招募Ｃａｓ９蛋白的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ復合體的發(fā)夾結構。作用原理如圖１－１....

圖２－１?ｇＲＮＡ和檢測引物位置示意圖??．－

２．２．１獲得同源重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕｒｏ－ＢＧＨ?ｐｏｌｙ?（Ａ）片段５’端添加Ｔ２Ａ和ＬＯＸＮ序列，構建同源??重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ?（圖２－２）。以ｐＳＭＰＵＷ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ載體為模板，使用高保真酶（Ｐｈａｎｔａ？??Ｓｕｐｅｒ－....

圖2-2LC)RN-Pwo結構以及PCR引物位置示意圖

圖２－１?ｇＲＮＡ和檢測引物位置示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｇＲＮＡ?ａｎｄ?ｐｒｉｍｅｒ?ｐｏｓｉｔｉｏｎ??２．２構建ＴＲＤＭＴｌ－ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ同源重組載體??２．２．１獲得同源重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕ....

圖２－３?ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ結構以及ＰＣＲ引物位置示意圖??

?２．２．２擴增左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ??利用引物擴增靶位點左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ?（圖２－３）。具體實驗方法如下：??（１）

本文編號：4000069