發(fā)布時間：2018-03-07 23:24

  本文選題：法舒地爾　切入點：RNA干擾　出處：《福建醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的LIMK1是調(diào)控細胞骨架的重要分子,課題組之前的研究表明,Rho激酶抑制劑法舒地爾可以下調(diào)成纖維細胞骨架運動相關(guān)蛋白LIM激酶1(LIM kinase,LIMK-1)的表達,從而抑制成纖維細胞的增殖和遷移,本研究旨在通過研究RNA干擾LIMK1對法舒地爾抑制尿道成纖維細胞遷移的影響,以闡明LIMK1是成纖維細胞遷移過程中重要的信號分子。材料和方法取原代兔尿道成纖維細胞進行體外培養(yǎng),并采用RNAi技術(shù)抑制LIMK1基因的表達,RT-PCR和Western blot檢測干擾效率。實驗分RNA干擾組(LIMK1抑制組)和未干擾組(LIMK1正常表達組),分別加入TGF-β1(10ng/m L)和法舒地爾(50μmol/L)進行干預(yù),共8個亞組。采用細胞劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗檢測各組成纖維細胞遷移能力;用流式細胞儀檢測細胞凋亡率;Western-blot檢測各組α-SMA、p-MLC、LIMK-1、p-Cofilin,以及I和III膠原蛋白表達情況。結(jié)果LIMK1基因抑制:Western blot結(jié)果顯示與正常對照組比較,R1-R3組si RNA分別使LIMK1蛋白的表達水平降低了52%、70%、90%,R3組si RNA抑制最明顯(P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:R3組si RNA下降最明顯(P0.05)。因此,選擇R3組si RNA抑制LIMK1。細胞劃痕和Transwell小室實驗顯示:RNA干擾組在24h的細胞遷移距離和穿膜細胞數(shù)要顯著少于未干擾組(P0.05),法舒地爾處理干擾組的遷移距離和穿膜細胞數(shù)要少于對照組(P0.05)。流式細胞儀檢測顯示:RNA干擾組的細胞早期凋亡率高于未干擾組(P0.05),且法舒地爾處理干擾組可以促進細胞凋亡(P0.05)。Westernblot檢測結(jié)果顯示:RNA干擾組α-SMA、LIMK-1、p-Cofilin,以及I和III膠原蛋白的表達要少于正常對照組(P0.05),而P-MLC表達無差異,法舒地爾處理干擾組蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論RNA干擾LIMK1通過下調(diào)Rho/ROCK信號通路關(guān)鍵蛋白p-Cofilin、α-SMA及I、III型膠原纖維蛋白表達,抑制成纖維細胞發(fā)生增殖和遷移,并增強法舒地爾抑制兔尿道成纖維細胞增殖和遷移能力。LIMK1可以做為治療尿道瘢痕的一個潛在新靶點。
[Abstract]:Objective LIMK1 is an important molecule regulating cytoskeleton. Previous studies have shown that the expression of cytoskeleton motility associated protein LIM kinase 1 (LIMK-1) can be down-regulated by fasudil, an inhibitor of cytoskeleton of fibroblasts. In order to inhibit the proliferation and migration of fibroblasts, the aim of this study was to investigate the effects of RNA interference with LIMK1 on the inhibition of urethral fibroblast migration by fasudil. In order to elucidate that LIMK1 is an important signal molecule in the process of fibroblast migration, the primary rabbit urethral fibroblasts were cultured in vitro. RNAi technique was used to inhibit the expression of LIMK1 gene by RT-PCR and Western blot to detect the interference efficiency. The experiment was divided into two groups: RNA interference group (LIMK1 inhibition group) and non-interference group (LIMK1 normal expression group), which were treated with TGF- 尾 1 10 ng / mL) and fasudil 50 渭 mol / L respectively. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect the migration ability of the fibroblasts. The apoptosis rate was detected by flow cytometry and Western-blot was used to detect the expression of 偽 -SMA-p-MLCp- LIMK-1p-Cofilin, and collagen I and III. Results LIMK1 gene inhibited the expression of LIMK1 protein in the control group compared with the control group. The results showed that si RNA of R1-R3 group decreased the expression level of LIMK1 protein, and the results showed that the expression level of LIMK1 protein in R1-R3 group was significantly lower than that in control group. The inhibition of si RNA in R3 group was the most obvious (P0.05N). RT-PCR results showed that the decrease of si RNA in R3 group was the most obvious (P0.05). Si RNA of R3 group was selected to inhibit LIMK1.The cell scratch and Transwell chamber experiments showed that the migration distance and the number of perforated cells in the interference group at 24 hours were significantly lower than those in the non-interference group (P 0.05), and the migration distance and the number of perforated cells in the interference group treated with fasudil were significantly lower than those in the control group. Flow cytometry analysis showed that the early apoptosis rate in the interference group was higher than that in the control group, and that in the interference group treated with fasudil could promote apoptosis. Western blot analysis showed that 偽 -SMALIMK-1 p-Cofilin, and I and III in the interference group were increased by Faxudil. The expression of collagen protein was lower than that of normal control group (P 0.05), but the expression of P-MLC was not different. Conclusion RNA interference with LIMK1 inhibits the proliferation and migration of fibroblasts by down-regulating the expression of p-Cofilin, 偽 -SMA and type III collagen fibrin in the Rho/ROCK signaling pathway. Enhancing the proliferation and migration of rabbit urethral fibroblasts by fasudil. LIMK1 may be a potential new target for the treatment of urethral scar.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R699.6

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本文編號：1581438