本文選題：黑色素瘤　切入點(diǎn)：基因治療　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：惡性腫瘤是21世紀(jì)以來嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一,是目前導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展,基因治療對(duì)惡性腫瘤的治療有著重要作用,特別是自殺基因治療,已經(jīng)成為繼傳統(tǒng)治療手段(如手術(shù)治療、放療、化療等)后一種治療腫瘤最具希望和挑戰(zhàn)的措施。本研究通過構(gòu)建重組慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光示蹤蛋白單純皰疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)基因載體,獲得重組活病毒并感染人黑色素瘤細(xì)胞A375,在確定黃酮類中藥活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)細(xì)胞縫隙連接功能(GJIC)的促進(jìn)作用,進(jìn)一步將中藥活性成分與自殺基因治療系統(tǒng)組成聯(lián)合治療方案,研究中藥活性成分聯(lián)合自殺基因治療系統(tǒng)的增效作用,通過本研究探討將自殺基因聯(lián)合中藥方藥活性成分的中西醫(yī)結(jié)合基因治療腫瘤方案的可行性。一、方法(一)人黑色素瘤細(xì)胞A375 HSVl-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建1綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk/GCV系統(tǒng)重組慢病毒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物,提取HEK293細(xì)胞總RNA, PCR反應(yīng)擴(kuò)增tk基因后,產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收。對(duì)tk基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及CD511B質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,T4 DNA連接酶連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行鑒定及序列測(cè)定；將構(gòu)建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤細(xì)胞A375 HSV1-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建用該重組質(zhì)粒pLV-tk/GFP與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T,獲得重組活病毒并感染人黑色素瘤細(xì)胞A375,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；使用熒光顯微鏡觀察GFP基因的表達(dá),GCV殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tk-GFP基因的活性。將篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞命名為A375-tk/GFP.(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞縫隙連接通訊功能的作用1 MTT法檢測(cè)人黑色素瘤細(xì)胞A375生長曲線。2 MTT法檢測(cè)0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素對(duì)A375細(xì)胞生長的影響,以確定用于研究的藥物濃度。3熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀熒光示蹤法分析縫隙連接通訊(GJIC)功能變化。用預(yù)標(biāo)記雙染料傳輸流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素對(duì)A375細(xì)胞GJIC功能的影響,并用熒光顯微鏡拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)并計(jì)算單綠色熒光細(xì)胞數(shù)量與熒光雙陰性細(xì)胞數(shù)量的比值,作為評(píng)價(jià)GJIC功能的指標(biāo)；比值越大表示細(xì)胞間形成GJIC功能越強(qiáng)。4 Western Blot檢測(cè)0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)A375細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43、Cx26表達(dá)的影響,對(duì)圖像進(jìn)行掃描分析。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞自殺基因的增效作用1 MTT法檢測(cè)0、2、5μmol/L GCV對(duì)0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP(tk+)細(xì)胞混合A375(tk-)細(xì)胞作用72h生長的影響,以確定聯(lián)合作用GCV濃度和tk+細(xì)胞的混合比例。2 MTT法檢測(cè)殺傷效應(yīng)。將tk+細(xì)胞按20%比例混合tk-細(xì)胞接種到96孔板�；旌霞�(xì)胞分為空白組、GCV組、木犀草素組、芹菜素組、槲皮素組、木犀草素聯(lián)合GCV組、芹菜素聯(lián)合GCV組和槲皮素聯(lián)合GCV組。培養(yǎng)24h后根據(jù)分組給藥,72h后以MTT檢測(cè)各組殺傷效應(yīng)。3熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀PI單染分析細(xì)胞凋亡。將tk+細(xì)胞按20%比例混合tk-細(xì)胞接種到12孔板�；旌霞�(xì)胞分為空白組、GCV組、木犀草素組、芹菜素組、槲皮素組、木犀草素聯(lián)合GCV組、芹菜素聯(lián)合GCV組和槲皮素聯(lián)合GCV組。培養(yǎng)24h后根據(jù)分組給藥,72h后以PI單染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況,并用熒光顯微鏡拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、結(jié)果(一)人黑色素瘤細(xì)胞A375 HSVl-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建1綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk/GCV系統(tǒng)重組慢病毒載體的構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pLV-tk/GFP分子量約為10.0kb,經(jīng)限制性酶切鑒定和DNA序列測(cè)定分析顯示,證明目的基因tk已經(jīng)成功連接到載體正確位置,測(cè)序結(jié)果與原始載體序列比對(duì),相應(yīng)序列100%完全一致,證明攜帶目的基因HSV1-tk的質(zhì)粒pLV-tk/GFP構(gòu)建成功。2人黑色素瘤細(xì)胞A375 HSV1-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建pLV-tk/GFP感染A375細(xì)胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素維持篩選濃度2周,熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)隨著時(shí)間的延長而逐漸增多、熒光增強(qiáng),最終獲得重組基因整合到染色體上的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,命名為A375-tk/GFP。采用MTT法檢測(cè)GCV對(duì)A375細(xì)胞、A375-tk/GFP細(xì)胞進(jìn)行殺傷試驗(yàn),GCV作用72h的細(xì)胞存活率結(jié)果顯示,GCV對(duì)A375-tk/GFP細(xì)胞有明顯的殺傷作用,而對(duì)未感染重組慢病毒的對(duì)照組A375細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明重組質(zhì)粒經(jīng)包裝后產(chǎn)生上清液含具有感染性的病毒顆粒,感染細(xì)胞后篩選的陽性抗性克隆細(xì)胞A375-tk/GFP能正常表達(dá)tk/GFP基因,表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞縫隙連接通訊功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素對(duì)A375細(xì)胞生長有較為明顯的抑制效應(yīng),6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)A375細(xì)胞殺傷作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系；本研究主要探討木犀草素、芹菜素及槲皮素通過GJIC或細(xì)胞凋亡機(jī)制增強(qiáng)對(duì)A375-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng),故選用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot檢測(cè)細(xì)胞縫隙連接功能和縫隙連接蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通過提高腫瘤細(xì)胞縫隙連接蛋白的Cx43和Cx26表達(dá)水平,促進(jìn)縫隙連接通訊的功能從而起到與自殺基因治療系統(tǒng)的協(xié)同增效作用,旁觀者效應(yīng)也可能是通過GJIC機(jī)制發(fā)生的。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞自殺基因的增效作用1 MTT法檢測(cè)2、5μmol/LGCV對(duì)20%～100% A375-tk/GFP細(xì)胞混合比例作用72h后,對(duì)顯著的殺傷作用,為了觀察木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV治療系統(tǒng),通過縫隙連接機(jī)制或細(xì)胞凋亡機(jī)制增強(qiáng)對(duì)A375-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng),故選用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP細(xì)胞混合比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。2木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯比相應(yīng)濃度單藥組和單純tk/GCV組高(P0.05),說明木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV系統(tǒng)能顯著提高tk+和tk-混合細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素聯(lián)合tk/GCV組,5、10、20μmol/L芹菜素聯(lián)合tk/GCV組,10、20μmol/L槲皮素聯(lián)合tk/GCV組,Q值均≥1.15,說明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有協(xié)同性增強(qiáng)tk/GCV系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用。3 PI單染檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,各中藥活性成分聯(lián)合tk/GCV組的細(xì)胞凋亡率均高于單純中藥活性成分組,PI單染法檢測(cè)結(jié)果各組細(xì)胞凋亡率的趨勢(shì)與MTT結(jié)果一致,實(shí)驗(yàn)證明,木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)A375-tk/GFP自殺基因治療系統(tǒng)具有增效作用。三、結(jié)論及展望上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①我們已成功構(gòu)建了綠色熒光示蹤蛋白慢病毒介導(dǎo)的HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)；②中藥活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通過提高縫隙連接蛋白的表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接功能；③將中藥活性成分和自殺基因療法組成聯(lián)合治療方案,對(duì)人黑色素瘤自殺基因治療系統(tǒng)具有協(xié)同增效作用。通過對(duì)人惡性黑色素瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究,表明自殺基因療法聯(lián)合中藥方藥活性成分,能夠通過促進(jìn)縫隙連接機(jī)制發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用,中藥方藥活性成分能夠提高腫瘤自殺基因治療的效果。初步證明了建立自殺基因聯(lián)合中藥方藥活性成分的中西醫(yī)結(jié)合基因治療腫瘤方案具有可行性。將中藥方藥活性成分與腫瘤自殺基因治療聯(lián)合,體外實(shí)驗(yàn)對(duì)自殺基因治療系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的研究結(jié)果顯示,中藥方藥活性成分能協(xié)同增強(qiáng)腫瘤自殺基因旁殺傷效應(yīng)的效果,其可能機(jī)制與中藥方藥活性成分通過促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接通訊功能(即縫隙連接機(jī)制)發(fā)揮作用。進(jìn)一步可以將其他的中藥方藥活性成分或旁殺傷效應(yīng)的其他增效機(jī)制,以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究做為我們今后研究工作方向的重點(diǎn)。目前腫瘤自殺基因治療尚未成熟,但通過將祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合,聯(lián)合自殺基因治療的增效作用的研究、建立及優(yōu)化工作將大有可為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5;R450

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 龔麗明,林世杰,王忠明;腫瘤的自殺基因治療研究進(jìn)展[J];腫瘤防治雜志;2004年05期

2 任濤;李枚娟;顏江華;;自殺基因治療惡性腫瘤的研究現(xiàn)狀及展望[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2009年12期

3 趙軍,馮躍,孟榮貴;與放療聯(lián)合的自殺基因治療的現(xiàn)狀[J];中國臨床醫(yī)學(xué);2002年05期

4 楊文宇,黃宗海;自殺基因治療惡性腫瘤的載體效率及基因表達(dá)[J];世界華人消化雜志;2004年01期

5 陳平;孫振華;;自殺基因治療腫瘤的現(xiàn)狀與展望[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2006年07期

6 曹安強(qiáng);戴天陽;;自殺基因治療肺癌研究進(jìn)展[J];西部醫(yī)學(xué);2008年03期

7 郭善禹;自殺基因治療腫瘤研究現(xiàn)狀與展望[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));1998年04期

8 宋艷斌;自殺基因治療的作用機(jī)制及其應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1999年05期

9 陳道楨;自殺基因治療腫瘤研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2002年01期

10 李王景,沈忠英;腫瘤自殺基因治療研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2000年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前3條

1 陳蘭英;屈二軍;;自殺基因治療在消化道腫瘤中的應(yīng)用[A];遺傳學(xué)進(jìn)步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

2 朱惠明;姜嶺梅;黃勛;;原發(fā)性肝癌的自殺基因治療[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十二次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2000年

3 杜標(biāo)炎;王慧峰;譚宇蕙;吳映雅;張立群;李杰芬;羅惠;易華;;六味地黃丸對(duì)小鼠移植性肝癌HSV-tk／GCV自殺基因治療增效作用的病理學(xué)研究[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第五屆基礎(chǔ)理論研究專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 黃暨生;木犀草素、芹菜素及槲皮素對(duì)黑色素瘤自殺基因治療的增效研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 沈歷宗;胞嘧啶脫氨酶自殺基因治療大腸癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2003年

3 譚萬龍;胞嘧啶脫氨酶和胸苷激酶融合雙自殺基因治療膀胱癌實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 劉菁;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的調(diào)控及其誘導(dǎo)腫瘤靶向自殺基因治療[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

5 王剛;microRNA-122調(diào)控的自殺基因治療肝癌的研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

6 詹楊;靶向性腺病毒介導(dǎo)的腫瘤自殺基因治療的應(yīng)用和甲基硒醇前藥與MDV3100在去勢(shì)抵抗型前列腺癌中聯(lián)合應(yīng)用的研究[D];吉林大學(xué);2013年

7 易華;從縫隙連接探討六味地黃丸對(duì)自殺基因治療肝癌的增效作用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年

8 李玢;薯蕷皂苷通過GJ機(jī)制發(fā)揮對(duì)B16細(xì)胞自殺基因的增效作用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

9 陳衛(wèi)國;全反式維甲酸增強(qiáng)前列腺癌自殺基因治療的旁觀者效應(yīng)及其與連接蛋白43的關(guān)系[D];蘇州大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 王慧峰;六味地黃丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌自殺基因治療增效作用的病理學(xué)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2005年

2 張英元;CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSV-TK/CD雙自殺基因治療人肺癌細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2011年

3 喻備;嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV治療大鼠膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

4 張愛娟;六味地黃丸含藥血清對(duì)肝癌自殺基因治療旁殺傷的增效作用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2007年

5 楊文宇;腺病毒介導(dǎo)雙自殺基因選擇性殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

，

本文編號(hào)：1578195