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稻曲病菌侵染水稻無(wú)雄蕊突變體的顯微結(jié)構(gòu)分析及激活水稻灌漿相關(guān)基因的初步

發(fā)布時(shí)間:2021-04-02 20:16
  水稻稻曲病(rice false smut,RFS)是由半知菌亞門(mén)綠核菌屬綠核菌引起的一種水稻穗部真菌病害,分布廣泛,危害嚴(yán)重。不僅危害糧食產(chǎn)量,其產(chǎn)生毒素還危害人畜健康。近年來(lái),該病害逐步上升為我們水稻新三大病害之一。關(guān)于稻曲病的研究也越來(lái)越多,但對(duì)于稻曲病的發(fā)病機(jī)理仍有許多未解之謎。最近研究表明,稻曲病菌特異侵染水稻花絲形成稻曲球,但也有研究者認(rèn)為花藥和柱頭也可能被侵染。對(duì)于花絲是否是稻曲病菌的唯一或必須侵染位點(diǎn)仍不明確。此外,我們前期研究中發(fā)現(xiàn)稻曲病菌侵染水稻穎花導(dǎo)致受精灌漿被阻斷、不能形成種子,但水稻灌漿相關(guān)基因被上調(diào)表達(dá)。由此猜測(cè)稻曲病菌侵染水稻后可能劫持水稻的灌漿系統(tǒng),將營(yíng)養(yǎng)用于稻曲球生長(zhǎng);诖,本論文利用顯微切片技術(shù)對(duì)一個(gè)無(wú)雄蕊突變體水稻進(jìn)行稻曲病菌侵染過(guò)程觀察,并對(duì)稻曲病菌激活水稻灌漿相關(guān)基因的分子機(jī)制開(kāi)展研究。主要取得了以下研究結(jié)果:(1)稻曲病菌能夠成功侵染無(wú)雄蕊突變體水稻,并形成稻曲球,說(shuō)明花絲并不是稻曲病菌成功侵染水稻穎花所必須的。(2)通過(guò)樹(shù)脂切片分析,發(fā)現(xiàn)稻曲病菌能夠侵染無(wú)雄蕊突變體水稻的子房及柱頭分支。(3)通過(guò)對(duì)稻曲球進(jìn)行透射電子顯微鏡分析,發(fā)現(xiàn)被稻曲病菌侵染后的水稻子房細(xì)胞出現(xiàn)類似正常灌漿子房細(xì)胞中的囊泡結(jié)構(gòu),暗示稻曲病菌侵染水稻穎花激活水稻灌漿過(guò)程。(4)為了明確水稻灌漿基因的激活是否是發(fā)病進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié),我們鑒定了灌漿缺陷突變體水稻gif1、risbzl和pdil-1,下一步將對(duì)其進(jìn)行稻曲病菌接種,分析發(fā)病進(jìn)程及稻曲球形成的變化。同時(shí),我們構(gòu)建了種子灌漿相關(guān)基因融合報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因水稻,為明確稻曲病菌激活水稻灌漿基因的時(shí)空特征提供了材料基礎(chǔ)。(5)利用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)篩選出三個(gè)能夠激活灌漿相關(guān)基因OsRISBZl的稻曲病菌效應(yīng)因子:UvGFA(Ustilaginoidea virens grain filling actor) 1,UvGFA2,UvGFA3。目前,正對(duì)這三個(gè)效應(yīng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。(6)利用本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)稻曲病菌效應(yīng)因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究,發(fā)現(xiàn)Uv_1214等15個(gè)效應(yīng)因子定位在核上和膜上,Uv_1114等6個(gè)效應(yīng)因子定位在膜上和質(zhì)體上,Uv 1324等7個(gè)效應(yīng)因子定位在膜上,效應(yīng)因子UvGFA3則呈點(diǎn)狀分布。綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)無(wú)雄蕊水稻突變體進(jìn)行稻曲病菌人工接種,發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有花絲的情況下稻曲病菌也能夠侵染水稻并形成稻曲球,突變體子房和柱頭分支可被侵染,說(shuō)明花絲并不是稻曲病菌的唯一侵染位點(diǎn)。稻曲病菌侵染水稻穎花不僅激活灌漿相關(guān)基因的表達(dá),而且使感病子房細(xì)胞中出現(xiàn)類似灌漿子房細(xì)胞中的囊泡結(jié)構(gòu)。稻曲病菌可能通過(guò)分泌效應(yīng)因子UvGFA1,UvGFA2,UvGFA3調(diào)控水稻灌漿基因的表達(dá),從而劫持營(yíng)養(yǎng)庫(kù)。本研究揭示了稻曲病菌侵染水稻的新途徑,提出了稻曲病菌侵染水稻形成稻曲球的特殊機(jī)制,對(duì)認(rèn)識(shí)與防控稻曲病具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:S435.111.4
文章目錄
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 稻曲病研究現(xiàn)狀
        1.1.1 稻曲病的發(fā)生與危害
        1.1.2 稻曲病的侵染機(jī)制
        1.1.3 稻曲病分子生物學(xué)研究進(jìn)展
        1.1.4 稻曲病的綜合防治
    1.2 病原菌效應(yīng)因子研究現(xiàn)狀
        1.2.1 植物免疫機(jī)制
        1.2.2 調(diào)控植物免疫的效應(yīng)因子
        1.2.3 調(diào)控植物代謝的效應(yīng)因子
    1.3 論文的選題依據(jù)及意義
2 稻曲病菌侵染水稻無(wú)雄蕊突變體的顯微結(jié)構(gòu)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 稻曲病菌菌株
        2.1.3 培養(yǎng)基的配制
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 稻曲病菌菌種保存
        2.2.2 稻曲病菌菌種活化與接種體制備
        2.2.3 人工接種稻曲病菌
        2.2.4 取樣
        2.2.5 光學(xué)顯微鏡(LM)和透射電子顯微鏡(SEM)制樣觀察
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 稻曲病菌侵染無(wú)雄蕊突變體水稻形成稻曲球
        2.3.2 半薄切片觀察分析
        2.3.3 超薄切片觀察分析
3 稻曲病菌激活水稻灌漿相關(guān)基因的初步研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料、實(shí)驗(yàn)樣品、稻曲病菌菌株
        3.1.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化所用的載體和菌
        3.1.3 主要試劑配制及試劑盒
        3.1.4 主要培養(yǎng)基
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 稻曲病菌菌種保存、菌種活化與接種體制備、人工接種稻曲病菌、取樣、透射電子顯微鏡制樣觀察
        3.2.2 水稻DNA提取
        3.2.3 載體構(gòu)建
        3.2.4 大腸桿菌和農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
        3.2.5 大腸桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化
        3.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定
        3.2.7 本生煙瞬時(shí)表達(dá)
        3.2.8 GUS染色
        3.2.9 稻曲效應(yīng)因子亞細(xì)胞定位
        3.2.10 熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)(DLR)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 稻曲病菌-子房界面細(xì)胞壁及囊泡結(jié)構(gòu)觀察
        3.3.2 水稻種子灌漿缺陷突變體的鑒定
        3.3.3 構(gòu)建種子灌漿相關(guān)基因融合報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因水稻
        3.3.4 篩選鑒定能激活水稻灌漿相關(guān)基因OsRISBZ1的稻曲病菌效應(yīng)因子
        3.3.5 稻曲病菌效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位分析
4 全文總結(jié)與討論
    4.1 稻曲病菌侵染水稻無(wú)雄蕊突變體子房與柱頭分支
    4.2 稻曲病菌激活水稻灌漿相關(guān)基因
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄Ⅰ 本實(shí)驗(yàn)所用引物
附錄Ⅱ 本實(shí)驗(yàn)中涉及基因ID
碩士在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào):1568949

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